不同甲酯化方法對裂壺藻產油脂肪酸的影響及GC-MS分析

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(1.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023;2.嘉必優生物工程(武漢)有限公司,湖北武漢 430073;3.湖北天基生物能源科技發展有限公司,湖北漢川 432300；4.中國科學院 武漢病毒研究所,湖北武漢 430071)

裂壺藻(Schizochytrium,又稱裂殖壺菌)是一類海洋真菌,裂壺藻藻油于2010年被衛生部指定為新資源食品,其富含ω-3系高度不飽和脂肪酸,主要包括二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等[1-2]。DPA和DHA都是人體所必需的脂肪酸,但在人體內難以合成,主要來自于海洋魚類和微藻,其中裂壺藻依靠連續二分裂法生殖,分裂速度快、發酵周期短,是商業化生產DHA藻油理想的菌種之一[3-5]。

藻油的主要脂肪酸為長鏈多不飽和脂肪酸,其酸極性很強,是熱敏性物質,在高溫下不穩定,易發生聚合、脫酸、裂解等副反應,沸點高,分析中易造成損失[6-7],通常先衍生為甲酯后再檢測分析。所以需要找到一種最適宜的甲酯化方法,以降低多不飽和脂肪酸的沸點并且減少其檢測過程中的流失[9-10]。脂肪酸的甲酯化方法有很多,包括酸處理法、堿處理法、三氟化硼(BF3)法、簡易堿式甲酯化方法、重氮甲烷法、四甲基氫氧化銨法等[11-12]方法。本文通過對裂壺藻進行培養發酵、收集藻體、酶法破壁、冷凍干燥等工藝得到干菌體,然后通過索氏抽提對干菌體提取油脂。采用了酸法、堿法和三氟化硼法三種甲酯化方法分別對提取的藻油進行甲酯化處理,用氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用技術分析,分別鑒定出脂肪酸組成,并對其主要成分進行對比[13-15]。通過比較裂壺藻藻油的脂肪酸組成差異,從而確定最適合的甲酯化方法,對微生物油脂的脂肪酸檢測有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

裂壺藻株 ATCC20888 購于廣東微生物菌種保藏中心,并經過等離子誘變獲得的裂壺藻突變株15 k-160 s-2-3,本實驗室保存；正己烷、無水甲醇、無水乙醚、無水乙醇、甲醇、硫酸、氫氧化鈉、14%三氟化硼甲醇、無水硫酸鈉 天津市科密歐化學試劑有限公司;纖維素酶(10-140萬U/g)、堿性蛋白酶(20萬U/g) 江蘇銳陽生物科技有限公司;所用試劑均為分析純。

LDZX-75KB立式蒸汽滅菌器 武漢利天科技儀器有限公司;SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;HYQ-150S恒溫搖床 武漢匯誠生物科技有限公司;TDL-5-A 臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;RE-52C 旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;索氏提取器 上海洪紀儀器設備有限公司;SY21-K 型電熱恒溫水浴鍋 北京長風儀器儀表公司;FD-8 冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;GC 7890A-MS 5975C 氣相色譜-質譜聯用儀 安捷倫科技(中國)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 裂壺藻培養基 種子培養基:葡萄糖8.5%、谷氨酸鈉6.5%、酵母膏0.6%、氯化鈉2.0%、磷酸二氫鉀0.65%、硫酸鎂2.2%、氯化鈣0.03%、碳酸氫鈉0.03%、硫酸鈉0.03%、金屬離子混合液(CoCl2,0.0065 g/L;MnCl2,0.1623 g/L;ZnCl2,0.0122 g/L;H3BO3,0.1020 g/L;FeCl3,0.0556 g/L;EDTA,0.15 g/L;CuSO4,0.0492 g/L)、維生素混合液(硫胺素,0.9973 g/L;生物素,0.110 g/L;鈷胺素,0.103 g/L);120 ℃、20 min。發酵培養基:葡萄糖7.5%、谷氨酸鈉1.5%、酵母膏1.1%、氯化鈉0.2%、磷酸二氫鉀0.5%、硫酸鎂0.6%、氯化鈣0.06%、碳酸氫鈉0.06%、氯化鉀0.04%、金屬離子混合液(CoCl2,0.0065 g/L;MnCl2,0.1623 g/L;ZnCl2,0.0122 g/L;H3BO3,0.1020 g/L;FeCl3,0.0556 g/L;EDTA,0.15 g/L;CuSO4,0.0492 g/L)、維生素混合液(硫胺素,0.9973 g/L;生物素,0.110 g/L;鈷胺素,0.103 g/L);120 ℃、20 min。

1.2.2 裂壺藻的培養 用接種環從固體培養基挑取藻種接入種子培養基中,置于搖床上,26 ℃、180 r/min條件下培養48 h。用滅過菌的吸管吸取10%的種子液,轉接于發酵培養基中,于26 ℃、180 r/min的條件下,振蕩培養2 d后將溫度降為22 ℃繼續發酵培養5 d[16]后提取油脂。

1.2.3 藻油的制備 發酵結束后,收集裂壺藻發酵液在5000 r/min的條件下離心10 min,去除上清液,重復此操作兩次。將離心得到的藻泥與水按料液比1∶1 (g/mL)混合均勻,置于恒溫磁力攪拌器中,溫度60 ℃下攪拌,按發酵液體積的0.5%和0.025%分別加入堿性蛋白酶和纖維素酶,55 ℃酶解6～8 h,置于真空冷凍干燥機中干燥至質量恒定,然后研磨成藻粉,裝入濾紙筒,放入索氏抽提器中,用乙醚注入索氏抽提,用略高于提取劑沸點的溫度,恒溫水浴抽提直至藻粉無色,旋轉蒸發殘留溶劑后得到藻油,收集備用。

1.2.4 脂肪酸甲酯化處理

1.2.4.1 酸法 稱取2.00 g的藻油于500 mL燒杯中;稱取5.00 g氫氧化鈉加至50 mL無水乙醇中,待其溶解后加至有樣品的燒杯中。燒杯置于70～75 ℃的水浴中皂化1 h。按1∶1體積比加入99%濃硫酸進行酸化。上層脂肪酸用蒸餾水洗至中性。取0.10 g脂肪酸于5 mL容量瓶中,加2～3 mL無水甲醇于水浴上加熱溶解。滴加濃硫酸6～8滴,充分搖勻。放置15 min后加入3～4 mL蒸餾水和1 mL正己烷,劇烈振搖2 min,靜置分層,取有機相待測[17-18]。

1.2.4.2 堿法 稱取0.2 g的藻油于20 mL試管中,加入0.5 mol/L的NaOH-CH3OH溶液2 mL,置于電熱恒溫水浴鍋,60 ℃條件下水浴加熱至油珠完全溶解(約30 min),冷卻后加入25%的BF3-CH3OH溶液2 mL,繼續水浴酯化3 min。冷卻后加入2 mL正己烷并振蕩,再加入2 mL飽和NaCl溶液并振蕩。靜置30 min后取上層有機相于一只干燥試管中,并加入少量無水硫酸鈉以去除微量水分,待測[19]。

1.2.4.3 三氟化硼法 稱取0.2 g的藻油,加入2 mL正己烷充分振蕩溶解后,加入1%硫酸-甲醇溶液2 mL混勻,置于65 ℃水浴加熱60 min,冷卻后加入25%的BF3-CH3OH溶液2 mL,65 ℃水浴酯化3 min,冷卻后加入飽和氯化鈉溶液至10 mL,振蕩離心取上清,待測[20]。

1.2.5 甲酯化溫度實驗 為了進一步優化甲酯化的條件,實驗選取影響藻油甲酯化的最敏感的因素溫度來進行實驗探索,分別選取甲酯化溫度50、55、60、65、70 ℃進行甲酯化并用GC-MS進行檢測分析,重復三次實驗。

1.2.6 色譜條件 色譜柱:HP-FFAP石英毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);升溫程序:140 ℃保持1 min,以5 ℃/min升溫至190 ℃,保持0 min,再以2 ℃/min升溫至220 ℃,保持10 min;進樣口溫度:250 ℃;載氣流量:1.0 mL/min;進樣量:1 μL;分流比:50∶1;溶劑延時:4.0 min。

1.2.7 質譜條件 電子轟擊(EI)離子源;電離能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;接口溫度250 ℃;全掃描模式,質量掃描范圍m/z 50～500。

1.2.8 分析鑒定 利用GC-MS分析,通過化學工作站G1701BA的數據處理系統,利用Nist11標準質譜庫檢索鑒定成分,按面積歸一化法進行定量分析,測得其相對百分含量。

2 結果與分析

2.1脂肪酸分析

按照實驗步驟進行實驗,結果由化學工作站給出，藻油的總離子流圖(TIC)分別示于圖1A(酸法)、圖1B(堿法)、圖1C(三氟化硼法),及DHA甲酯的質譜圖2。

圖1 DHA藻油脂肪酸甲酯總離子流圖Fig.1 TIC profile of fatty acids methyl ester in DHA algae oil注:A.酸法;B.堿法;C三氟化硼法。

圖2 DHA(C22∶6)甲酯的質譜圖Fig.2 Mass specutrum of DHA(22∶6)methyl ester

將三種甲酯化方法處理的DHA藻油經GC-MS分析檢測,各脂肪酸的組成及占總油的相對百分含量列于表1。

表1 DHA藻油脂肪酸的鑒定結果Table 1 Summary of identification of fatty acids in DHA algae oil

注:-表示未檢出。

由表1可知,采用酸法可鑒定出11種脂肪酸,占總DHA藻油的89.50%。其中棕櫚酸占藻油總量的15.15%,二十二碳五烯酸酸(DPA)占藻油總量的16.91%,二十二碳六烯酸(DHA)占藻油總量的38.89%。采用堿法可鑒定出19種脂肪酸,占總的DHA藻油的97.88%。其中棕櫚酸占藻油總量的13.91%,DPA占藻油總量的20.54%,DHA占藻油總量的46.76%。采用三氟化硼法可鑒定出12種脂肪酸,占總的DHA藻油的90.12%。其中棕櫚酸占藻油總量的16.94%,DPA占藻油總量的15.94%,DHA占藻油總量的40.54%。所確定的化學成分的質譜圖由聯用儀的計算機譜圖庫檢索,所檢測出的脂肪酸的可信度大部分均在90%以上。

根據藻油的檢測結果可以看出,堿法鑒定出的脂肪酸成分多于酸法及三氟化硼法,且鑒定的脂肪酸占藻油總量的比例均有差異,尤其是長鏈多不飽和脂肪酸DHA和DPA有著較大的差異,原因可能是酸法步驟較多,并且在皂化酸化過程中溫度過高,使脂肪酸發生了變性,被轉化為其他非酸類物質,通過化學工作站對酸法的總離子流圖的分析,也發現有較多的醇醛類化合物離子峰。而堿法及三氟化硼法本質的區別在于堿法用的是堿處理法,而三氟化硼法則用的是酸處理法,由實驗結果可以得知,藻油富含多不飽和脂肪酸,用堿處理法則更加適用,能檢測出較多脂肪酸成分,并且在甲酯化過程中對DHA等長鏈多不飽和脂肪酸的保護作用較強,不易造成流失,因而選擇堿法為藻油的最優甲酯化方法。再對其甲酯化溫度進一步實驗得到最佳的酯化溫度,從而對藻油更科學精準的檢測有著較完整的探究。

2.2甲酯化溫度的優選

對于堿法的實驗過程中,影響甲酯化效果的因素有很多,甲酯化過程中的水浴溫度對結果有很大的影響。實驗選取溫度來進行探索,分別考察甲酯化溫度50、55、60、65、70 ℃進行甲酯化并用GC-MS進行檢測分析,重復三次實驗后用DHA、DPA的相對含量作為衡量指標得出的結果如圖3所示。

圖3 甲酯化溫度對DHA、DPA的相對含量的影響Fig.3 The influence of esterification temperature on the relative content of DHA and DPA

由圖3可以看出,在甲酯化溫度為55 ℃時DHA的含量達到了47.45%,DHA及DPA的相對含量達到最高,當溫度高于55 ℃以上時,DHA及DPA的相對含量開始逐漸降低。這一結果表明藻油在甲酯化過程中對溫度的要求較高,甲酯化溫度對藻油中DHA和DPA的含量有很大的影響。所以,為了避免溫度對脂肪酸檢測結果的影響,應當選擇適宜的溫度(55 ℃)對藻油進行甲酯化處理。

3 結論

裂壺藻是產DHA油脂的優良菌株之一,然而長鏈多不飽和脂肪酸酸極性很強,在檢測過程中有一定的難度,因而需要找到一種最適宜的甲酯化方法。本文采用三種不同的甲酯化方法鑒定同一批的裂壺藻藻油,并利用GC-MS進行分析檢測,得到良好的實驗結果。綜合對比分析了三種甲酯化方法的優劣,最終選擇堿法為藻油的最優檢測方法,該方法檢測效率高,操作簡便快捷,長鏈不飽和脂肪酸DHA、DPA在甲酯化過程中保存較完整,流失少。實驗進一步優化了甲酯化方法,選取溫度來進行實驗探索,最終得到堿法的最佳甲酯化溫度為55 ℃。這一研究為微生物藻油的檢測奠定良好的基礎。

隨著人們對多不飽和脂肪酸日益增長的需求,除了要從高產菌株的選育、發酵工藝的優化、設備的選型配套等方面做出研究外,對藻油的檢測及標準也不容忽視。本文探索了藻油檢測過程中三種不同的甲酯化方法,并采用氣相色譜-質譜聯用儀對藻油脂肪酸進行了分析檢測,實驗結果對發酵過程的調控及多不飽和脂肪酸的檢測有著一定的借鑒意義。

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