植物分子遺傳學在挖掘作物重金屬積累相關基因中的作用

黃新元，趙方杰

（南京農業大學資源與環境科學學院，作物遺傳與種質創新國家重點實驗室，南京 210095）

隨著我國工業化、城市化的快速發展，土壤重金屬污染問題日益突出。2014年原環保部和原國土資源部發布了全國土壤污染狀況調查報告，報告指出我國耕地土壤點位污染物含量超標率達19.4%，其中重金屬鎘和類金屬砷的超標率分別為7%和2.7%，污染程度以中、低污染為主[1]。由于農田重金屬污染造成的農產品重金屬超標時常發生，其中以我國南方稻米重金屬含量超標尤為嚴重[2]。根據Du等[3]和Zhu等[4]的調查結果顯示，我國湖南益陽地區和長株潭地區分別有60%和76%的稻米鎘含量超過我國食品衛生標準中稻米鎘限量值（0.2 mg·kg-1），其中樣品最高含量甚至超過限量值的24倍。湖南和廣東地區受采礦影響的稻田稻米砷含量超標率也達到50%[5]。由于土壤重金屬的污染造成農產品重金屬含量升高，已經導致了我國居民鎘的攝入量逐年增加。我國國家衛生和計劃生育委員會對我國居民人均每天鎘的攝入量進行了長達25年的調查，結果顯示我國居民人均每天鎘的攝入量已從1990年的13.8 μg·d-1上升到了2015年的30.6 μg·d-1，25年間升高了122%，達到了世界衛生組織和世界糧農組織規定的日均鎘允許攝入量的61%[6]。對居民膳食來源分析表明，稻米是我國居民膳食中鎘的主要來源，占人均每天鎘攝入量的55%，其中在南方人群中則占到了65%[6]。因此，由于農田重金屬污染造成的農產品重金屬超標已對我國居民身體健康構成了威脅，成為限制我國農產品質量安全和農業生產可持續發展的一個重要因素。

為保障農產品產地可持續利用及農產品質量安全，2016年國務院發布了《土壤污染防治行動計劃》，提出了到2020年和2030年，受污染耕地安全利用率分別達到90%左右和95%以上的指標。然而，由于我國農田重金屬污染范圍較廣、形態類型復雜，污染耕地的治理將是一個長期的過程。同時為了保持糧食總產量和保住18億畝（1.2億hm2）耕地的底線，我國很多重金屬中、低度污染農田仍繼續從事高強度的農業生產，導致類似“鎘大米”等農產品重金屬超標事件頻繁發生。因此，在這種國情下，研發阻控作物重金屬積累的策略，保證農產品的質量安全和污染農田的安全利用，已成為我國目前農業生產的當務之急。

對于重金屬中、低程度污染的農田，降低農產品重金屬污染最有效并可以持久的策略是通過遺傳改良和基因工程方法培育重金屬低積累的作物品種，阻控重金屬向可食部位的轉運。而這一策略的實現需要建立在植物分子遺傳學的方法上克隆與重金屬吸收、轉運和積累等相關的功能基因，并且在系統、深入了解作物重金屬積累的分子遺傳調控機理的基礎上。本文將在介紹常用基因定位克隆方法的基礎上，以目前已經克隆的控制水稻吸收、轉運和積累鎘的相關基因為例，介紹如何通過分子遺傳學的方法克隆這些基因，并對這些基因控制重金屬積累的分子遺傳機理進行闡述，同時展望這些基因在培育重金屬低積累品種中的應用前景。

1 定位克隆控制重金屬積累相關基因的常用方法

常用的定位和克隆控制作物重金屬積累相關基因的方法主要有同源克隆和QTL（數量性狀位點）定位方法。其中QTL定位包括連鎖分析法和關聯分析法等。

1.1 同源克隆

同源克隆的方法主要基于模式物種中已知具有控制重金屬吸收、轉運等功能的基因，根據這些基因的序列信息在作物中尋找與該基因序列保守的同源基因或者基因家族。然后將這些基因在作物中進行過量表達，或者通過RNA干涉（RNAi）、CRISPR/Cas9基因編輯等技術將這些基因的表達量降低或將基因進行敲除，考察轉基因植株是否出現重金屬吸收、轉運和積累等表型的變化，從而明確這些同源基因是否具有控制作物重金屬吸收、轉運和積累的功能。同源克隆的方法主要用于早期沒有基因組信息的農作物，利用細菌、酵母等低等生物以及擬南芥等模式植物中已經發現的控制重金屬吸收和轉運的相關基因，在水稻、小麥和玉米等基因組中尋找相關基因的同源基因。同源克隆的方法是從“基因”到“表型”，因此是一種反向遺傳學的方法。隨著作物基因組信息逐步完善，基因組上許多基因的功能都被注釋。根據基因注釋的功能，結合基因的表達模式，如在根內皮層或者節的維管束細胞特異表達等信息，挑選與重金屬積累相關的轉運蛋白進行過量表達或者基因敲除等，研究它們是否出現重金屬積累相關表型，是目前通過反向遺傳學克隆重金屬積累相關基因的常用手段。

1.2 QTL定位與基因克隆

作物重金屬含量是呈現連續變異的性狀，因此屬于數量性狀。與其他農藝數量性狀一樣，作物重金屬含量大都由多個數量性狀基因位點（QTL）所控制。QTL定位的基本原理是通過建立適當的分離群體，發展分布較均勻的、覆蓋全基因組的、具有多態性的分子標記，構建密度較高的分子標記連鎖圖譜。然后利用分子標記對分離群體中的每個單株進行基因型鑒定，同時測定各單株的重金屬含量等表型，隨后對單株的標記基因型和性狀的表型值進行統計分析，從而確定控制重金屬含量相關QTL位點在分子標記連鎖圖中的位置。通過QTL定位分析，可以獲得控制重金屬含量的基因位于基因組上的初步位置，進一步通過精細定位和轉基因互補實驗，最終克隆到相應的基因。QTL定位主要涉及到定位群體的構建、分子標記的研發、遺傳圖譜的構建和進行連鎖分析或者關聯分析。

用于定位控制重金屬積累相關QTL的定位群體主要有F2群體、重組自交系群體（RIL群體）、導入系群體（IL群體）、雙單倍體群體（DH群體）和自然品系群體。F2群體是由兩個親本雜交后獲得F1，將F1自交后所構建的群體。由于F2群體的下一代還會繼續分離，因此是一種臨時性群體，主要應用于突變體和重金屬極端積累品種的初步定位。RIL群體是在F2群體的基礎上，對下一代的每個株系隨機選擇一粒種子自交，連續進行多代自交獲得的高世代單株，一般要自交到6代以上，其大部分基因組序列已經純合，各染色體融合了雙親的片段。與RIL群體不同，IL群體在通過雙親雜交之后與其中一個親本（受體親本）進行多代回交，同時每一代都對各單株進行基因型鑒定，挑選染色體特定片段為其中一個親本（供體親本），而基因組其他位置為受體親本，最終獲得的IL群體覆蓋了供體親本的全基因組，群體中每個株系帶有供體親本基因組的不同染色體片段，而背景與輪回親本相同。與RIL群體相比，IL群體由于具有一致的遺傳背景，因此具有可以檢測QTL間的上位效應、QTL定位靈敏度更高等優點。RIL群體和IL群體都需要經過多代的自交或者雜交，因此構建通常耗時很長。DH群體是由兩個親本雜交獲得F1后，將F1通過花藥組培將單倍體花粉經過人工加倍形成二倍體成苗，從而將F1雜合基因組固定為純合，大幅縮短了群體構建的時間。與F2群體的后代還需繼續分離不同，RIL群體、IL群體和DH群體的單株基因組基本純合，下一代基因型基本不再分離，因此是永久性定位群體。自然群體則由不同的品種構成，這些品種從種質資源中根據品種間親緣關系進行選擇，一般用于全基因組關聯分析。

構建好定位群體后，在測定各株系重金屬含量進行表型鑒定的同時，需要利用分子標記對群體中的各株系進行基因型分析。早期常用的分子標記主要有限制性片段長度多態性標記（RFLP）、隨機擴增多態性DNA標記（RAPD）、簡單重復序列標記（SSR）、擴增片段長度多態性標記（AFLP）和酶切擴增多態性序列標記（CAPS）等。隨著高通量測序技術的迅速發展，目前常用的是單核苷酸多態性標記（SNP）。與上述標記相比，SNP標記在基因組上存在的數量更為豐富。在對群體各株系進行基因型鑒定之后，根據各分子標記之間的交換頻率，確定它們在染色體上的位置，即構建分子遺傳圖譜。基于分子遺傳圖譜，將各株系的表型與基因型進行統計分析，即QTL定位分析。QTL分析主要分為連鎖分析和關聯分析，前者可以分為單標記分析法、區間作圖法和復合區間作圖法等，而后者則基于連鎖不平衡，將全基因組的SNP標記與表型進行關聯分析。全基因組關聯分析（GWAS）是最近十幾年來興起的QTL定位分析方法，主要利用到具有遺傳多樣性較高的自然群體。與基于雙親的連鎖分析不同，GWAS利用的是數百個品種構成的自然群體，遺傳多樣性更加豐富。同時由于GWAS采用的是覆蓋全基因組的高密度SNP標記，QTL定位的精度通常要比連鎖分析高很多。目前，通過GWAS對重金屬含量進行QTL定位已經有不少報道[7-9]。

2 定位克隆控制重金屬積累相關基因的實例

目前在水稻等農作物中已經克隆出了多個控制重金屬積累的相關基因。本研究以重金屬鎘為例，介紹如何通過分子遺傳學的方法定位和克隆控制水稻鎘吸收、轉運和分配的三個基因：OsNRAMP5、OsH?MA3和CAL1。

2.1 定位克隆控制水稻根部鎘吸收的OsNRAMP5基因

水稻主要是通過根系從土壤中吸收鎘，大氣沉降的鎘通過葉片吸收占籽粒鎘的積累貢獻非常小。因此，通過控制水稻根系鎘的吸收可以有效減少鎘在籽粒的積累。在水稻中，鎘主要是通過錳和鎘的轉運蛋白OsNRAMP5進行吸收，由兩個日本研究所團隊采用完全不同的方法獨立發現[10-11]。Sasaki等[10]采用的是反向遺傳的方法，并對OsNRAMP5的作用機制進行了深入的研究；而Ishikawa等[11]則通過正向遺傳學的方法克隆到了OsNRAMP5基因，該研究通過輻射誘變獲得的osnramp5突變體可以應用于低鎘水稻育種。NRAMP基因編碼的是天然免疫力相關巨噬細胞蛋白，最先是在哺乳動物中被克隆[12]。隨后研究表明NRAMP蛋白家族具有轉運錳、鎘、鐵、銅和鋅等二價陽離子的活性。模式植物擬南芥和水稻中分別有6個和7個NRAMP基因，其中擬南芥的AtNRAMP1、At?NRAMP2和AtNRAMP4均具有轉運錳、鎘、鐵的活性，而AtNRAMP6只特異轉運鎘[12-17]。在水稻中，OsN?RAMP1具有轉運鐵和鎘的活性而不具有錳的轉運活性[16，18]，OsNRAMP6 則具有轉運三價鋁離子的活性。為了研究水稻其他OsNRAMP基因的功能，Sasaki等[10]通過反向遺傳學的方法，獲得了OsNRAMP5基因T-DNA插入突變體，發現突變體根部錳、鎘的吸收大幅度降低，其莖葉和籽粒錳、鎘含量也顯著降低。進一步研究發現OsNRAMP5蛋白定位在根部的外皮層和內皮層細胞外側的細胞膜，負責將錳、鎘離子轉運到根細胞中。由于OsNRAMP5在錳吸收上起重要作用，在水培條件下osnramp5突變體比野生型對缺錳更為敏感[10，19]。Ishikawa等[11]則采用正向遺傳學的方法克隆OsNRAMP5基因，他們將水稻粳稻品種越光進行離子束輻射誘變構建突變體庫，通過對2592個突變單株進行篩選，獲得了3株籽粒鎘含量降低的突變體。通過將突變體與秈稻品種Kasalath雜交構建F2群體，利用圖位克隆的方法，發現突變體中OsN?RAMP5基因發生突變而喪失了功能，從而引起根部鎘的吸收減少，籽粒鎘的含量降低。在不同的大田種植條件下，野生型籽粒鎘的含量為0.6～1.8 μg·g-1，而osnramp5突變體籽粒鎘的含量最高僅為0.03 μg·g-1[11]，顯示了通過破壞OsNRAMP5基因的功能可以很好地控制鎘在籽粒中的積累。因此，通過正向遺傳學和反向遺傳學的方法，均克隆到了控制根部鎘吸收的關鍵基因OsNRAMP5。

2.2 定位克隆控制鎘在水稻根部液泡區隔化的OsH?MA3基因

鎘離子通過植物根部吸收進入植物體內后通常被區隔化到液泡中。在水稻中這一過程由P-1B型重金屬ATP酶OsHMA3負責[20]。OsHMA3基因是通過QTL定位克隆到的。Ueno等[21]測定了146份水稻品種地上部鎘含量，篩選到多份地上部鎘含量極端高的品種。隨后選取高鎘品種Anjana Dhan和低鎘品種日本晴構建F2定位群體，將控制高鎘基因定位在水稻7號染色體上1.9 Mb的范圍內[22]。為了進一步縮小定位，他們構建了包含965個單株的F2群體，并在定位區間內發展了新的分子標記。利用這些分子標記在F2群體中篩選重組交換個體，通過對交換個體的基因型和表型進行分析，最終將高鎘基因定位在159 kb的范圍內。通過對QTL定位區間內的候選基因進行序列測定、在酵母檢測鎘的轉運活性和轉基因互補實驗等，最終將高鎘基因確定為OsHMA3基因。OsHMA3基因在根部各層細胞均表達，其編碼的蛋白定位在液泡膜上，負責將鎘轉運到液泡中儲存。在高鎘品種中，由于OsHMA3基因發生突變造成功能喪失，不能將鎘轉運到液泡中而被轉運到地上部和籽粒中，從而出現地上部和籽粒鎘含量升高的表型[20]。利用相同的QTL定位方法，Miyadate等[23]也在高鎘品種Cho-Ko-Koku中克隆到了OsHMA3基因，而且OsHMA3基因在Cho-Ko-Koku和在Anjana Dhan兩個品種中具有相同的突變位點。事實上，OsHMA3基因在水稻品種中存在多種功能喪失型的突變形式，都造成了地上部和籽粒鎘含量的升高[24]。由于OsHMA3可以將鎘轉運到液泡中，而水稻根系中OsHMA3基因表達量較低，通過強啟動子驅動其過量表達，可以將鎘截留在根部液泡中，從而減少鎘向地上部的運輸和在籽粒的積累。將過量表達OsHMA3的轉基因植株和非轉基因對照植株種植于含有1.5 mg·kg-1鎘的污染土壤中，對照植株籽粒鎘含量達到5.5 μg·g-1左右，而轉基因植株則只有0.2 μg·g-1左右[20]。因此，過量表達OsHMA3與破壞OsRNAMP5基因的功能一樣，都具有很好的控制鎘在籽粒積累的效果。

2.3 定位克隆控制鎘在水稻分配的CAL1基因

雖然通過破壞OsNRAMP5的功能和過量表達OsHMA3可以有效降低籽粒鎘的積累，但是污染農田中的鎘仍然滯留于農田土壤中。如果能將鎘定向地分配到水稻地上部秸稈等非可食部分，而不向籽粒中積累，既可以保證水稻安全生產，同時又將通過秸稈將鎘進行移除修復，這種“修復型”的水稻品種有望可以實現重金屬中、低度污染農田的“邊生產邊修復”。

最近，Luo等[25]在“修復型”水稻的遺傳基礎解析方面取得了重大進展，克隆到了一個特異調控鎘在水稻葉片中積累的主效QTL基因CAL1。他們對212份能較好代表中國水稻遺傳多樣性的核心種質資源和一些代表水稻品種進行篩選，鑒定出了鎘高積累的水稻品種臺南1號（TN1）。利用TN1和春江06（CJ06）構建的雙單倍體群體對葉片鎘含量進行QTL定位分析，定位到3個分別位于水稻2、4、11號染色體的QTL位點。隨后他們對定位在2號染色體上貢獻率為12%的QTL位點進行了精細定位。通過將TN1與CJ06進行連續多代回交，獲得了QTL定位區間攜帶有來源于TN1的基因組片段，而基因組其他片段均來源于CJ06的染色體單片段置換系。與TN1一樣，染色體單片段置換系的葉片鎘含量也是高的。通過染色體單片段置換系與CJ06回交獲得的包含3651單株的回交F3代，將控制葉片鎘含量的基因定位在56 kb的基因組范圍內，該區域內僅含有4個候選基因。通過轉基因將這4個候選基因分別轉到低鎘品種CJ06中，發現僅其中一個候選基因CAL1可以提高CJ06葉片鎘的含量，從而證明了CAL1是控制葉片鎘含量的基因。CAL1基因編碼一個植物防御素類似蛋白，該蛋白定位在細胞壁上。CAL1基因主要在根的外皮層和中柱木質部薄壁細胞以及劍葉的葉鞘木質部薄壁細胞中表達。CAL1蛋白可以通過其蛋白上的巰基與鎘進行螯合，鎘與CAL1結合之后可以從木質部薄壁細胞的細胞質中分泌出來，進入木質部中參與向地上部的長距離轉運，從而促進鎘在葉片的積累。由于鎘與CAL1的緊密結合，可能影響了螯合態的鎘再次跨細胞膜進入韌皮部向水稻籽粒的再分配過程，從而定向調控鎘在葉片等營養器官的積累而不影響籽粒中鎘的積累[25]。因此CAL1基因可以應用于培育秸稈鎘高積累而籽粒鎘含量達標的“修復型”水稻品種，有望實現重金屬中、低度污染農田的“邊生產邊修復”。

3 展望

隨著分子遺傳學、基因組學等學科的迅速發展，越來越多與重金屬積累相關基因被發現。同時，隨著包括基因編輯技術等技術的興起，這些基因將有望應用于培育作物重金屬低積累品種，實現對重金屬中、低污染農田的安全利用。例如最近通過CRISPR/Cas9基因編輯技術將兩系雜交稻的兩個親本華占和隆科638S中的OsNRAMP5基因同時進行敲除，以這兩個親本組配的雜交稻其籽粒鎘含量比雙親降低了95% 以上[26]。在土壤鎘含量為1.69～2.37 mg·kg-1的污染大田條件下，兩親本籽粒鎘含量超標10倍左右，雜交稻的籽粒鎘含量仍然低于國家標準0.2 μg·g-1，表現出很好地控制鎘在籽粒中積累的效果[26]。雖然通過輻射誘變或者基因編輯的方法都可以破壞OsN?RAM5基因的功能從而降低鎘的吸收，但是OsN?RAMP5同時也負責吸收必需礦質營養元素錳[10，27]，并參與體內錳從根部向地上部的轉運以及再分配[19]。因此在水培條件osnramp5突變體對缺錳更為敏感[10，19]，這可能限制了其在低錳農田中的應用。下一步通過結構生物學的方法，解析或者預測OsNRAMP5蛋白的三維結構，利用單堿基基因編輯技術改變蛋白的關鍵氨基酸位點，從而改變OsNRAMP5蛋白對金屬離子的選擇性，使其只轉運錳而不轉運鎘，這將極大地提高OsNRAMP5基因的應用價值。

另外，過量表達OsHMA3同樣可以明顯地降低籽粒鎘的積累[20]。最近克隆的特異定向調控鎘在葉片等營養器官積累的CAL1基因，有望通過原位過量表達等手段，提高鎘在水稻秸稈中富集的同時保證籽粒鎘含量不超標，實現對鎘中、低污染農田安全利用的同時對鎘進行移除修復。上述兩個基因都需要通過轉基因的方法才能發揮阻控鎘在籽粒中積累的作用，但目前我們國家尚未允許種植轉基因水稻，這將極大地限制這些基因的應用。然而，包括OsHMA3和CAL1在內的基因都是水稻基因組中原本就存在的基因，并非外源基因，這些基因在控制鎘積累的機制也十分清楚，通過轉基因技術獲得的低鎘稻米，其食品安全性將會顯著提升。因此，我們不應盲目地排除轉基因技術在培育重金屬低積累品種中的應用。通過CRISPR/Cas9基因編輯技術對基因進行敲除，可以在后代中分離得到不含轉基因成分而目標基因被改造的植株，這應該更容易被大眾所接受。

通過在水稻種質資源中挖掘重金屬低積累優異等位基因，利用分子標記輔助選擇育種的方法培育重金屬低積累品種，是目前阻控重金屬積累的一個很好的策略。隨著高通量測序的成本越來越低，越來越多的水稻品種基因組被重測序，基因型的鑒定比以往更為簡單和準確。同時伴隨著離子組學、表型組學等學科的興起，可以對多種元素進行高通量的測定，使表型的鑒定更為迅速和精確。因此，在種質資源中挖掘與重金屬積累相關的自然變異優異等位基因將更為便捷，有望進一步通過全基因組選擇等先進的育種手段，培育重金屬低積累水稻新品種，實現重金屬中、低污染農田的安全利用。