無創產前診斷單基因遺傳病的研究進展

史云芳，張穎

單基因遺傳病是由1個或1對等位基因突變引起的疾病，符合孟德爾遺傳規律。雖然每種單基因病的發病率較低，但因其種類較多，總體患病率并不低。據統計，每1 000個活產兒中就有40～82人患有單基因遺傳病［1］。截止到2018年6月11日，已明確發病機制的單基因遺傳病有5 262種（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/）。目前多數單基因遺傳病尚無有效的治療方法，致死、致畸和致殘率高，給家庭和社會造成了巨大負擔，因此避免此類患兒出生尤為重要。

傳統的產前診斷方法是通過絨毛膜取樣或羊膜腔穿刺獲得胎兒樣本后進行產前診斷。該方法對于孕婦及胎兒是創傷性的，有流產、死胎等風險［2-3］。妊娠婦女血漿中胎兒游離DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）的發現［4］使無創產前檢測（non-invasive prenatal testing，NIPT）篩查胎兒染色體非整倍體成為可能，并已廣泛用于胎兒常見染色體非整倍體的篩查。隨著研究的不斷深入，利用cffDNA進行無創產前診斷（non-invasive prenatal diagnosis，NIPD）單基因遺傳病的研究也取得一些成果。本文主要對NIPD的研究進展及其面臨的挑戰做一綜述。

1 NIPD常用的技術方法

目前無創產前診斷單基因遺傳病的主要技術包括：（1）PCR技術，如實時PCR（Real-time PCR）、限制性內切酶PCR（PCR with restriction enzyme digest，PCR-RED）和微滴式數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）等。（2）環化單分子擴增和重測序技術（circulating single - molecule amplication and resequencing technology，cSMART）。（3）第二代測序（next-generation sequencing，NGS）等［5］。

1.1 PCR技術

1.1.1 Real-time PCR Real-time PCR是通過擴增胎兒通用序列，如Y染色體序列以確定胎兒性別或RHD基因確定胎兒RH血型，來診斷單基因遺傳病，而不是直接檢測基因突變，比如僅在男胎中確診杜氏肌營養不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD），或僅在女胎中確診先天性腎上腺皮質增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH），這樣避免了大約50%的有創產前診斷。在英國等國家和地區，通過cffDNA檢測Y染色體已經成為嚴重性連鎖遺傳病標準產前服務的一部分，2011年英國遺傳監測網批準3個實驗室開展該技術用于無創產前診斷［5］。

1.1.2 PCR-RED 早期一些NIPD是應用PCRRED檢測基因突變，如與軟骨發育不全、致死性軟骨發育不良相關的FGFR3基因突變［6］，其原理是應用限制性內切酶切斷包含突變位點的DNA序列，再通過瓊脂糖凝膠電泳判定結果。該方法準確，快速，費用相對低，但評價結果主觀性強，大約7%～8%無肯定結論，也不適用所有突變［5-6］。除此之外，該方法1次僅能發現1個突變，適合檢測已知突變。在超聲結果提示胎兒異常或突變未知，尤其是多種突變引起的異常時，該方法并不適用。盡管存在這些限制，英國國民健康服務（National Health Service,NHS）于2013年仍將該技術用于無創產前診斷［2］。

1.1.3 ddPCR ddPCR是一種新型的、可對DNA或RNA進行絕對定量的檢測技術，每個微滴作為一個獨立的PCR反應，擴增后利用探針上的特異性熒光信號對每個微滴進行檢測，最后根據泊松分布原理，計算出原始樣本的濃度。該方法與Real-time PCR不同，不依靠擴增曲線進行定量，不受擴增效率影響，也不依賴復雜的生物信息學分析，在痕量樣本檢測等方面具有明顯優勢［7］。Camunas-Soler等［8］應用ddPCR技術成功無創產前診斷了9例單基因遺傳病，包括血友病、鳥氨酸氨甲酰基轉移酶缺陷癥、囊性纖維化、β-地中海貧血、甲羥戊酸激酶缺乏癥、乙酰膽堿受體缺陷癥和常染色體隱性遺傳非綜合征型耳聾，在孕11周時即可做出診斷，cffDNA比例最低僅為3.7%。Gruber等［9］應用該技術檢測4對神經纖維瘤NF1突變基因和4對囊性纖維化CFTR突變基因的夫婦，研究結果顯示所有母體血漿樣本中都正確地確定了父源性突變基因的存在與否。該技術也被用在血友病F8和F9基因突變［10］和甲基丙二酸血癥MUT基因突變［11］的無創產前診斷中。

雖然ddPCR在無創產前診斷中具有較高的敏感度和特異度，但需要針對不同家系的突變設計相應的探針，不能對所有家系設計通用的檢測體系，而且cffDNA片段較短，在探針和引物設計方面難度較大。

1.2 cSMART cSMART技術是一種對血漿中游離DNA低比例突變進行定性和絕對定量的新型檢測技術，可以消除潛在的PCR擴增偏倚，精確量化原始血漿樣本中突變等位基因的比例［12］。該方法已經用于無創胎兒單基因遺傳病的檢測、腫瘤靶向用藥及療效動態監測。Lv等［12］首先應用該技術對4個威爾遜病（Wilson disease，WD）家族的ATP7B基因突變進行了無創產前診斷，結果與有創產前診斷結果一致。因為該方法只需知道父母的致病性突變，使其有望成為各種單基因遺傳病NIPD的通用策略。Han等［13］也應用該方法對 80個攜帶GJB2或SLC26A4基因突變的常染色體隱性遺傳性非綜合征型耳聾家系進行無創產前診斷，與傳統產前診斷方法相比，91.3%的胎兒得到正確診斷，有5例樣本由于cffDNA比例低（＜6%），與傳統產前診斷結果不一致；如果cffDNA比例＞6%，則該方法的敏感度和特異度達到100%和96.5%。此外苯丙酮尿癥中PAH基因突變［14］也可用該方法進行檢測。

1.3 NGS NGS的出現，尤其是臺式測序儀的出現，使NIPD的范圍逐漸擴大，從定向擴增選定基因中含有多個已知突變［6,15］，到遺傳分析更為復雜的隱性遺傳病［16］、X連鎖遺傳病［17］和母源性顯性遺傳病。和PCR-RED技術相比，該方法可以同時分析FGFR3基因的29個已知致病突變［6］，顯著提高了檢測覆蓋度和敏感度，在2014年被NHS準入臨床應用［2］。該方法已有廣泛的驗證，而檢測流程僅需5 d［2,6］。

2 無創產前診斷策略

NIPD最直接的方法是在母血中檢測出異常突變，已經從最初的識別父源性遺傳的變異發展到用于更復雜的基因突變。

本試驗考察了不同提取方式、不同提取時間以及不同提取溶劑下的樣品色譜圖，對比各條件下的譜圖的分離情況確定供試品溶液制備條件，具體條件見“2.3”項下。

2.1 父源性常染色體顯性遺傳病以及新發突變 NIPD用于臨床首先是針對父源性常染色體顯性遺傳病，即排除或識別父源性變異和檢測出新發變異。在這種情況下，技術方法簡單直接，因為導致突變的父源性基因并不存在于母體內，通過檢測母體血漿中父源性等位基因的存在與否即可對胎兒進行診斷。隱性遺傳病中父源性突變的缺失將提示胎兒為攜帶者或正常。2002年Gonzales-Gonzalez等［18］利用PCR和限制性內切酶分析在母體血漿中發現了一種父源性遺傳的引起囊性纖維化的突變。然而，母體DNA的高背景意味著只能檢測到父源性突變，無法評估胎兒是否也攜帶母體突變的可能性，這就需要通過有創產前診斷來確定母親等位基因的遺傳。

2.2 常染色體隱性遺傳病和X連鎖遺傳病 對于常染色體隱性遺傳病和X連鎖遺傳病，需要確定是否有母源性突變基因的遺傳。這一技術難度較高，因為母體血漿中DNA主要來源于母親，背景高，NIPD時需要評價突變基因和野生型基因的相對數量。為了提高敏感度，目前常用的2種分析方法是相對突變劑量（relative mutation dosage，RMD）和相對單倍型劑量（relative haplotype dosage，RHDO）。

2.2.1 RMD RMD方法是根據母體血漿中突變等位基因和野生型等位基因的比例來推斷確定胎兒基因型。如果為純合子患兒，該比值會升高；如果胎兒和母親基因型相同，即為攜帶者，該比值相等；如果胎兒為野生型純合子，該比值降低［2,5］。Perlado等［19］使用RMD結合ddPCR方法計算母體血漿中cffDNA的比例，通過檢查不同等位基因并計算其是否平衡來無創診斷母源性遺傳的單基因遺傳病。如果母體和胎兒基因型之間等位基因平衡，通過檢測SRY序列（用于妊娠男胎）或通用標記RASSF1A（胎兒超甲基化，母親去甲基化）來確認胎兒DNA的存在（用于妊娠女胎）［2］。該方法敏感度、特異度高，可以檢測單核苷酸多態性（SNPs）位點和微小缺失，操作流程相對簡單，但只適合檢測1個已知突變，而且需要根據不同突變設計不同探針，不能檢測大的結構變異和有相似序列的突變。

2.2.2 RHDO RHDO方法是通過比較母體血漿中突變基因和野生型等位基因周圍SNP位點的相對量來推斷胎兒單倍型。該方法將RMD方法和連鎖分析結合起來，通過對一系列SNPs進行測序來實現單倍型分析。分析中包含的SNP數量越多，統計能力越強［2,5］。Parks等［17］設計靶向NGS捕獲測序突變基因周圍的高雜合度SNPs，構建單倍型，然后使用先證者的SNPs推斷受影響的單倍型并分類母體SNPs，計算母體血漿中各單倍型的低表達或過表達，從而無創產前診斷DMD和貝氏肌營養不良（Becker muscular dystrophy，BMD）。 研 究 發 現RHDO在精確定位重組位點上是有效的，同時顯示母體血漿中胎兒比例＞4%的情況下，該方法的準確度達到100%。RHDO也被用于分析CAH［20］和脊肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）［16］，這兩種疾病的致病基因由于存在高度同源性的假基因，設計特異性檢測較為困難，無法直接進行突變分析。RHDO的主要優點是分析不受突變類型的限制，適用于有假基因、大的基因缺失和致病突變位于重復區域的情況［20］，檢測效率高，可以一次發現多個突變。目前其已被用于囊性纖維化的確診，并用于臨床［2,21］。RHDO方法也有一定的局限性［5］，其一是近親結婚妊娠時，由于缺少有信息的SNPs，無法推斷單倍型；其二是需要受累親屬的DNA做單倍型分類，如果沒有先證者樣本，檢測將無法進行。

最近10×Genomics公司的linked-read測序技術解決了沒有先證者而無法進行無創產前診斷這一難題。Hui等［22］直接分析父母單倍型，將父親、母親的完整DNA序列包裹到凝膠珠上，使DNA被片段化，并用條形碼標記；經過測序后，基于條形碼將DNA分子重新組裝成單倍型；分析父母單倍型并確定致病基因位點附近的SNP后，用RHDO方法分析母體血漿DNA的測序數據，推測胎兒的突變狀態。該方法只需要分析父母的單倍型，無需先證者樣本，使其在臨床上更為實用。

Vermeulen等［23］在NIPD中采用靶向位點擴增（targeted locus amplication,TLA）技術來分析父母單倍型。其原理是利用基因位點的空間接近性，交聯感興趣基因周圍的序列（包含致病突變），選擇性地反向PCR擴增并測序，有相同變化的被分為一個單倍型。隨后，分離母體血漿中cffDNA，富集突變位點的片段并進行測序，用單倍型數據和cffDNA數據推斷胎兒的遺傳狀態；該方法在18例妊娠婦女中得到驗證，主要包括CFTR、CYP21A2和HBB基因，與有創產前診斷結果一致，在妊娠早期階段（8周）即可做出診斷。但將這種方法用于由基因重復引起的疾病上則需要進一步優化。與linked-read測序技術相比，該方法不需要專門設備，在任何遺傳學實驗室都可較容易地實現，避免了測序的昂貴費用，對數據分析、存儲計算要求較低。在此基礎上，Vermeulen等［23］提出，需要經過大規模的臨床試驗，才能驗證兩種方法在敏感性和準確性、成本效益方面誰更優異。

3 臨床應用中NIPD面臨的問題

如何在臨床中應用NIPD仍面臨許多問題，有一些局限性需要考慮，包括實驗方法的有效性，尤其涉及罕見突變，胎兒DNA的比例及樣本處理流程，檢測費用等，同時建立質量保證體系也很必要。

3.1 母體血漿中胎兒DNA的比例 母體血漿中細胞游離DNA來源于母親細胞和胎盤滋養層細胞的凋亡。雖然胎兒游離DNA大約占5%～10%，且隨著孕周增加而增加，但其相對數量在孕期是高度變化的，影響因素包括孕周、胎盤大小、母親是否吸煙、母親體質量指數和母親是否有先兆子癇等［24］。考慮到這些不可預知的因素，NIPD時測量胎兒DNA的比例是非常重要的質控參數。尤其是出現陰性結果時，有可能是胎兒DNA濃度低于檢測范圍［5］。

有多種方法可以測量胎兒DNA在母體血漿中的比例，包括片段大小、上下游序列、甲基化的不同、男胎出現Y染色體、顯示父源性遺傳的SNP等［25］。胎兒DNA的比例很難準確測定，尤其濃度低時，各方法之間也有差異。應用NIPD時測量胎兒DNA在母體血漿DNA中的比例，可以作為質控參數。

3.2 樣本處理和DNA提取 母體血漿細胞游離DNA是母親DNA和胎兒DNA的混合物。當用EDTA抗凝管采集母體外周血后，母體白細胞會繼續降解，使得其游離DNA比例相對增加。所以臨床應用NIPD之前，需要進一步研究樣本處理及其處理時間，取血后必須盡快分離血漿以維持胎兒DNA的最大比例。這點對NIPD尤為重要，因為NIPD是依賴相對突變或單倍型分析，而不是直接檢測有無突變。當不能及時分離血漿時，需采用維持細胞穩定的采血管，以減少溶血，使胎兒DNA比例最大化［5］。

無論是人工還是自動提取DNA的方法，都需要經過長期評估，以優化提取方法，確保短的胎兒DNA片段能被有效提取。采用的方法很大程度上依靠樣本量，優化流程后即能產生相對高質量的DNA。

臨床工作中，監管樣本類型和處理時間也是必須的。必須提供清晰的樣本處理和運輸流程，以優化下游的DNA提取和檢測。

3.3 假陽性和假陰性 在NIPD中可以觀察到假陽性，特別在孕早期，可能是由于存在1個未被發現的雙胞胎，但由于胚胎停止發育而未被發現，影響NIPD結果，可以通過超聲掃描來避免此種情況的出現［2］。低比例的母體嵌合也可能導致假陽性結果，可以同時分析母體基因組DNA以避免。由于母體血漿中cffDNA濃度低，極易發生假陰性，因此Hayward等［2］建議在NIPD時同時識別父源性遺傳等位基因、Y染色體序列或雜合SNPs或進行RASSF1A分析，以證明胎兒DNA的存在。

3.4 質量控制 無論什么新方法應用到NIPD中，確定其準確性和可靠性是非常重要的。每次試驗及臨床應用時，都需要質量控制。NIPD中，質控參數包括最小測序深度和胎兒DNA比例。如果胎兒比例過小，需隨著孕周增大再重復實驗。為了符合醫學實驗室國際標準，如ISO 15189:2012，實驗室需要參加室間質評（EQA），但是仍有一些特殊設計的NIPD設計較難，費用高，無法參加EQA。實驗室之間樣本交換可以解決這一問題，但缺乏可操作性。如果結果不滿意，尚未找到有效的解決方法［5］。

3.5 費用 產前分子診斷的局限性之一就是費用問題。因為父母需要早期無創產前診斷的結果，相應的實驗室投入增加，所以費用也在升高。使用NGS方法或增加病例研究，可能降低費用。增加樣本量也可以降低費用，但需要在選定的實驗室集中測試。Verhoef等［26］研究顯示，對于父源性突變或新發突變，每周無創產前診斷2～3例樣本，NIPD較侵入性診斷便宜；在用RHDO方法確診囊性纖維化等隱性遺傳病或特殊設計NIPD檢測方法時，費用較有創檢測增加一百多英鎊；假基因的存在使分析復雜并增加成本500～900英鎊。而遇到罕見遺傳病時開發NIPD并不合算。但隨著測序成本的下降，經濟形勢將發生變化，NIPD的價格將變得更加低廉，更容易被接受。

4 結語與展望

利用母體血漿DNA無創產前診斷胎兒單基因遺傳病是產前診斷的巨大進步，診斷疾病的種類在逐漸增加，從最初只能鑒定是否遺傳父源性突變，到可以分析更為復雜的隱性遺傳病、X連鎖遺傳病和母源性顯性遺傳病，而且避免了有創產前診斷帶來的流產等風險，使得有家族史的夫婦可以獲得早期安全的產前診斷。

但臨床應用中NIPD仍面臨許多挑戰，對于復雜的單基因遺傳病或罕見突變，試驗過程繁瑣，費用較高，其大規模用于臨床還有一段時間。隨著NIPD的發展，在今后的臨床實踐中，還需制定檢測標準和指導方針，建立質量保證體系和專業培訓，以及商討可能出現的倫理問題。