表皮干細胞的特點及應用于皮膚軟組織創面修復的實驗研究進展*

尹詩璐 綜述 秦澤蓮 審校

(北京大學第三醫院成形外科，北京 100191)

意外傷害造成的復雜大面積創面以及各種疾病導致的慢性難愈性創面往往難以修復。自體皮片或皮瓣移植是目前整形外科常用的修復方法，然而供皮區所形成的新的創面往往帶來一定的功能及形態損傷。隨著微創外科理念的廣泛深入，如何通過最小的創傷達到最佳修復效果成為各外科專業的研究重點及難點。表皮干細胞研究為大面積皮膚創面的微創修復提供了新的啟示。提取自皮膚組織的特異性干細胞，具有自我增殖及分化形成多種皮膚細胞成分的能力，在皮膚軟組織創面愈合及再生中發揮重要作用[1,2]。本文對表皮干細胞的特點及其在皮膚軟組織創面修復中的實驗研究進展進行綜述。

1 表皮干細胞的特點

1.1 表皮干細胞的形態及分布

表皮干細胞來源于外胚層，形態呈鵝卵石形，胞體透亮且排列緊密，主要分布于皮膚基底層及毛囊隆突部位，并且隨個體年齡和部位不同而有所差異。作為慢周期細胞，表皮干細胞的增殖分化受到壁龕(niche)及細胞內信號通路的影響。壁龕是表皮干細胞賴以生存的外部微環境，主要有三種，分別位于表皮細胞基底層、毛囊隆突部位及皮脂腺基底部[3]。不同的壁龕對表皮干細胞的生理狀態、信號傳導及分化方向產生不同的影響[1,4,5]。2012年，Dahl[6]的研究顯示，表皮基底層、皮脂腺和毛囊隆突區域分布有豐富的表皮干細胞，這些細胞可分化成不同的皮膚細胞，替換死亡的表皮、皮脂腺和毛囊細胞，從而維持皮膚的自我更新及穩態。

1.2 表皮干細胞的篩選及鑒定

在過去的10余年中，表皮干細胞的篩選及鑒定方法得到不斷改善。Ⅳ型膠原快速黏附法是目前常用的篩選表皮干細胞的簡單方法，表皮干細胞表面高表達β1整合素，而有絲分裂后細胞及終末分化細胞不表達β1整合素，利用這一特性將細胞置于預鋪Ⅳ型膠原的培養皿中，表皮干細胞依靠其β1整合素能較為快速地與Ⅳ型膠原進行黏附而與其他細胞成分區分開[7,8]。流式細胞分選法則利用表皮干細胞高表達α6整合素而不表達CD71的特性，通過設立特定的門控通道而高效分選出α6整合素+CD71-的表皮干細胞[9]。此外，通過免疫熒光、免疫組化、基因表達檢測等方式，檢測整合素α6、P63、K19等的表達也是較為常用的表皮干細胞篩選鑒定方式[7]。除了以上常見的表面標志物，也有文獻報道應用delta樣蛋白1(delta-like protein 1，DLL1)、富含亮氨酸的重復序列和免疫球蛋白樣結構域蛋白1(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains protein 1，LRIG1)、CD46作為標志物進行表皮干細胞的篩選[2,7,10]。

1.3 表皮干細胞的分化及增殖特點

表皮干細胞不斷通過自我分裂及分化維持皮膚的穩態。2001年，Dunnwald等[11]應用Hoechest和碘化丙啶熒光染色方法，通過設定特定的門控，證實鼠表皮基底細胞存在干細胞[(3.4±0.2)%]、短暫擴增細胞[(89.2±1.1)%]和非增殖細胞[(7.4±0.9)%]3種不同分化狀態。在受到特定刺激信號后，表皮干細胞不均等分裂形成新的表皮干細胞及若干短暫擴充細胞，短暫擴充細胞再通過有限的細胞分裂形成終末細胞。由于這3種細胞增殖能力不同，在體外培養時分布形成3種不同的細胞克隆[1]：①全克隆(holoclone)，克隆細胞集群大而圓，其內細胞成分主要是小而形態規則的干細胞，具有很強的自我增殖能力，高表達β1整合素、K14、P63等細胞標記，可不均等分裂成干細胞及短暫擴增細胞。②部分克隆(meroclone)，主要由短暫擴增細胞形成，細胞大小不等，自我增殖及分化能力存在差異，由于在向低分化細胞分化的過程中逐漸脫離了干細胞壁龕環境，這一細胞P63的表達水平明顯低于干細胞。③次全克隆(paraclone)，克隆面積小且形態不規則，其內幾乎均為終末分化細胞，細胞大而扁平，且高表達終末分化細胞標記物內皮蛋白(involucrin)，通常僅能維持較短的復制周期，便逐漸喪失增殖能力。

2 表皮干細胞修復皮膚軟組織創傷的實驗研究

表皮干細胞是皮膚及其附屬器發生、修復、重建的基礎，在保持皮膚正常結構、維持表皮的自我更新和穩態方面起著重要作用。1984年首次出現應用體外培養的表皮干細胞治療大面積皮膚燒傷的案例報道[12]，2例全身燒傷95%以上的患兒(Ⅲ度燒傷面積分別為83%和89%)，應用體外培養的表皮干細胞成功覆蓋50%以上燒傷創面，同時挽救了生命。

2.1 表皮干細胞促進急、慢性創面的愈合

創傷可刺激表皮干細胞增殖分化，形成新的子細胞填充皮膚組織缺損[13,14]。在基底層完整的情況下，基底層表皮干細胞逐漸自下而上脫離壁龕，通過自我增殖分化進行創面修復。若基底層同時受到破壞，則主要依靠傷口邊緣附屬器內的表皮干細胞向傷口分化、增殖、遷移而進行修復功能[15]。β1整合素是表皮干細胞進行壁龕黏附的重要分子，在創傷早期表皮再生中發揮重要作用[1]。創傷后，表皮干細胞的β1整合素消失，使其失去黏附作用向創面移動，進行分裂啟動修復功能[16]。在移動過程中，新生成的短暫擴增細胞高表達磷酸化P63，保持增殖功能的同時繼續向表面移動，填補細胞空缺，促進創面愈合[13]。1999年，Pellegrini等[17]應用富含表皮干細胞的自體角質細胞移植治療7例20%～45%皮膚全層燒傷，其中6例在移植術后1個月創面表皮再生覆蓋達100%，1例覆蓋達80%。此外，Mascre等[18]的示蹤研究還顯示表皮干細胞對創傷組織的修復和再生起著重要作用，其能在創面基底迅速形成克隆向創面中心擴展，僅3.5天，60%干細胞已經經歷了一輪細胞分裂。同時證實表皮干細胞是創面中長期發揮作用的細胞，(3.8±0.1)細胞克隆/mm2在移植后35天密度仍可達(2.6±0.1)細胞克隆/mm2。

除了大面積燒傷和急性創傷，糖尿病潰瘍等慢性難愈性創面的修復也是目前表皮干細胞治療研究的熱點。隨著人口老齡化，肥胖人群增多，糖尿病的患病率逐年增長，糖尿病潰瘍的發生率也持續上升，這類創口往往難以自愈，可遷延數月甚至數年。現有治療方法包括組織工程皮膚產品、局部應用生長因子、電刺激、負壓吸引等，都難以達到滿意效果[13]。2016年，Yang等[19]用糖尿病潰瘍動物模型進行研究，觀察到表皮干細胞能夠通過Notch信號傳導通路促進糖尿病潰瘍創面的愈合，這一通路中的Jag1能夠促進表皮干細胞向創面遷移，應用Jag1轉染的表皮干細胞治療的鼠糖尿病潰瘍創面在15天時明顯小于未轉染的表皮干細胞治療的創面。

隨著體外細胞技術的發展，利用表皮干細胞自我增殖的特性，體外培養擴增獲得上皮皮片，移植于創面進行修復，從而彌補了自體皮片供區不足的缺點。經過不斷的技術改進，自體擴增皮片已經成為目前治療大面積燒傷皮損及慢性創面的可行手段[2]。2010年，Sood等[20]報道一項為期18年的臨床研究，對88例大面積燒傷創面患者進行自體擴增皮片移植，分別對其移植存活率、水皰發生率、創面攣縮發生率等并發癥進行3～90個月的隨訪，結果顯示應用這一技術治療的大面積燒傷患者，總生存率達91%(80/88)，自體擴增皮片移植的成活率高達72.7%，有66%的患者(58/88)出現創面攣縮，其中32例行攣縮松解手術。

2.2 表皮干細胞與皮膚附屬器再生

表皮干細胞在傷口愈合中的作用不僅僅局限于再生形成分層的表皮，還與毛囊、汗腺等重要皮膚附屬器的再生密切相關。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細胞外信號調節激酶(ERK)信號通路是汗腺發生和發育過程中的重要信號通路，抑制MAPK/ERK通路的磷酸化在表皮干細胞向汗腺細胞分化過程中十分重要[21]。在培養基中加入PD98059可阻斷ERK磷酸化，從而抑制MAPK/ERK通路，促使表皮干細胞退出干細胞群落，向汗腺細胞方向分化[22]。同時，創面底部的表皮干細胞在創傷刺激下能夠大量分裂增殖并向創面遷移，在增厚的瘢痕乳頭層部位形成毛囊樣結構[23]。有研究表明，創面中心的表皮細胞具有更大的形態可塑性，能夠與創面下方的真皮共同作用，參與創面毛囊的再生[24]。2017年，王元元等[25]將體外培養的人表皮干細胞接種在組織工程真皮上，加入不同濃度的表皮生長因子(EGF)，進行三維培養和定向誘導分化，通過HE染色及CK19熒光染色，結果表明在15～20 ng/ml濃度的EGF誘導下，表皮干細胞能形成管腔樣結構，該管腔樣結構由單層細胞構成的管壁和中央空腔組成，在形態學、組織學上與在體汗腺分泌部的管狀結構相似，且抗CKl8和抗-CEA免疫熒光染色均表達陽性，從而證實表皮干細胞參與創面皮膚附屬器的再生。

2.3 表皮干細胞與創面瘢痕調控

表皮干細胞對創面瘢痕的形成過程產生影響[26]。P63和ki-67的異常表達與瘢痕形成關系密切。Edriss等[27]對瘢痕形成時期的表皮干細胞進行染色，觀察到其核蛋白P63和ki-67的表達明顯增強，證實其在瘢痕形成過程中的活性增強。Wang等[28]的研究證實表皮干細胞能夠下調轉化生長因子β1(TGF-β1)，促進堿性成纖維生長因子(bFGF)的表達及細胞橋粒形成，與表皮干細胞共同培養的真皮細胞外基質分布良好，未見膠原束形成，且膠原mRNA和蛋白表達水平下降至46%，從而減緩皮膚纖維化的進程及緩解瘢痕形成。

3 小結

表皮干細胞研究的擴大及深入，為創面修復研究提供了新的思路。現有研究提示我們，具有自我增殖及多項分化能力的表皮干細胞在創面覆蓋、皮膚附屬器再生、瘢痕修復等方面有一定的研究基礎及誘人的應用前景。然而目前關于表皮干細胞的臨床應用研究仍然十分匱乏，大量的研究仍然停留在基礎層面而缺乏臨床證據支持。如何將基礎研究轉化為臨床應用，讓表皮干細胞在創傷修復領域真正發揮其作用，仍需更進一步的探索。