糖與溫度對(duì)短柄細(xì)葉連蕊茶花粉活力的影響

于波 朱玉 黃麗麗 孫映波 吳華玲

摘 要 為了建立短柄細(xì)葉連蕊茶（Camellia parvilimba Merr. et Metc. var. Brevipes Chang）花粉檢測(cè)和低溫保存的方法，克服該物種與其他山茶物種間因開(kāi)花時(shí)間與空間不同所造成的雜交育種障礙，開(kāi)展了糖與溫度對(duì)短柄細(xì)葉連蕊茶花粉活力的影響研究。采用離體萌發(fā)法，研究糖的種類(lèi)（蔗糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖和山梨醇）、濃度（0.146～0.876 mol/L）、低溫（5～25℃）或高溫（30～35℃）處理以及-80℃低溫貯藏對(duì)花粉萌發(fā)的影響。結(jié)果表明：花粉在含有0.292 mol/L的蔗糖或乳糖的培養(yǎng)基中萌發(fā)率較高，分別可達(dá)16.17%和16.08%。低溫處理（5～25℃）對(duì)花粉萌發(fā)無(wú)不良影響，但高溫（≥30℃）能造成花粉萌發(fā)率顯著降低。經(jīng)30℃處理6 h后，花粉萌發(fā)率顯著下降至10.20%。花粉在-80℃條件下貯藏12個(gè)月后，萌發(fā)率仍可達(dá)11.12%。本研究為今后利用短柄細(xì)葉連蕊茶開(kāi)展山茶物種間雜交育種，克服花期不遇等問(wèn)題提供技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞 短柄細(xì)葉連蕊茶 ；花粉 ；生活力 ；貯藏力

中圖分類(lèi)號(hào) S685.14 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.09.005

Abstract In order to establish a method for pollen detection and cryopreservation of Camellia parvilimba and overcome the obstacle of cross breeding between Camellia parvilimba and other species due to the difference of flowering time and space， the effect of carbohydrate and temperature on the pollen vigor of C. parvilimba Merr. et Metc. var. Brevipes Chang was analyzed. The effects of carbohydrate （sucrose， lactose， glucose， maltose and sorbitol）， concentration （0.146 ～ 0.876 mol/L）， low temperature （5～25℃）， high temperature （30～35℃） and low temperature storage （-80℃） on pollen germination of C. parvilimba were studied through in vitro germination. The results showed that pollen germination rate was higher in the medium containing 0.292 mol/L sucrose or lactose， up to 16.17% and 16.08%， respectively. Low temperature （5～25℃） had no bad effect on the pollen germination， but the germination rate of pollen decreased significantly under high temperature （≥30℃）. After the pollen was treated for 6h at 30℃， the pollen germination rate dropped to 10.20%. After the pollen was stored for 12 months under -80℃， the germination rate was up to 11.12%.

Keywords Camellia parvilimba ； pollen ； vitality ； storage capacity

連蕊茶組（Sect. Theopsis Coh. St.）是山茶科山茶屬重要的一組植物，共49種，我國(guó)原產(chǎn)46種[1]。該組植物主要特點(diǎn)：花量大，花朵密集，多數(shù)種類(lèi)具芳香氣息[2]；但也有不少缺點(diǎn)：花朵單瓣，花徑較小，色澤多為白色，比較單一，且葉片較小較薄，樹(shù)枝較細(xì)偏軟等。短柄細(xì)葉連蕊茶（Camellia parvilimba Merr. et Metc. var. Brevipes Chang）是連蕊茶組小喬木，產(chǎn)于我國(guó)廣東和江西[1]，樹(shù)體玲瓏，枝葉稠密，花小秀雅，花瓣背帶淡紅色可觀樹(shù)、觀花，可作花境、花壇、林叢類(lèi)應(yīng)用，具有很高的觀賞和園林應(yīng)用價(jià)值[3]。

迄今為止，只有少數(shù)連蕊茶物種被引種馴化并用于茶花人工雜交育種，包括短柄細(xì)葉連蕊茶在內(nèi)的大多數(shù)連蕊茶還未系統(tǒng)地參與茶花的人工育種。因此，利用這些連蕊茶物種資源與茶花品種進(jìn)行種間雜交，將二者具有的優(yōu)勢(shì)性狀互補(bǔ)，充分利用雜種優(yōu)勢(shì)改良傳統(tǒng)茶花，培育特色優(yōu)良的茶花新品種是今后茶花育種的重要工作。目前，已有川鄂連蕊茶（C. rosthorniana）和毛柄連蕊茶（C. fraterna）的花粉培養(yǎng)與低溫貯藏的研究報(bào)道[2，4]，但未見(jiàn)短柄細(xì)葉連蕊茶花粉生活力和低溫貯藏的研究報(bào)道。在許多研究報(bào)道中，糖和溫度是花粉離體萌發(fā)的主要影響因素[5-23]。本研究以短柄細(xì)葉連蕊茶花粉為試材，研究了糖的種類(lèi)、低溫或高溫處理以及-80℃低溫貯藏對(duì)花粉萌發(fā)的影響，旨在為今后利用短柄細(xì)葉連蕊茶開(kāi)展山茶屬物種間雜交育種，克服花期不遇等問(wèn)題提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為短柄細(xì)葉連蕊茶，種植于浙江金華國(guó)際山茶物種園。采集即將開(kāi)放，但尚未散粉的短柄細(xì)葉連蕊茶的花蕾，置于干燥處12 h，（25±1）℃。待花藥打開(kāi)散粉時(shí)，收集花粉。先用鑷子將散粉的花藥輕輕取下，放在紙片上，干燥處放置24 h，（25±1）℃；然后將花粉連同花藥殼一起分裝到1.5 mL凍存管中，擰緊管蓋，放入-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 花粉生活力測(cè)定

花粉萌發(fā)適宜糖類(lèi)測(cè)定：分別將含有0.292 mol/L的糖即蔗糖（100.0 g/L）、麥芽糖（105.2 g/L）、葡萄糖（52.6 g/L）、乳糖（100.0 g/L）和山梨醇（52.6 g/L）的5種固體培養(yǎng)基（8 g/L瓊脂，pH 5.5～6.0）加熱滴于載玻片上，冷凝后，用無(wú)菌牙簽將新鮮花粉均勻涂撒在培養(yǎng)基表面。將載玻片置于放有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)盒內(nèi)，然后將培養(yǎng)盒裝入塑料自封袋密封，置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)（25±1）℃，培養(yǎng)24 h后，于顯微鏡下觀察拍照和統(tǒng)計(jì)，根據(jù)萌發(fā)率確定花粉萌發(fā)的適宜糖類(lèi)。

花粉萌發(fā)適宜蔗糖濃度測(cè)定：設(shè)計(jì)5種蔗糖濃度，分別為0，0.146、0.292、0.584、0.876 mol/L，8 g/L瓊脂，pH 5.5～6.0。培養(yǎng)24 h后，于顯微鏡下觀察拍照并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，以確定適合短柄山茶花粉萌發(fā)的適宜糖濃度。

低溫或高溫對(duì)花粉萌發(fā)影響的測(cè)定：模擬華南地區(qū)冬、春季夜間較低溫度（5～20℃）和中午較高溫度（25～35℃），將花粉培養(yǎng)分為2個(gè)階段，第一階段設(shè)置7種溫度，分別為5、10、15、20、25、30和35℃進(jìn)行6 h培養(yǎng)處理，模擬夜間低溫或中午高溫。第二階段轉(zhuǎn)移至（25±1）℃條件下恢復(fù)培養(yǎng)18 h，顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，以測(cè)試冬春季夜晚低溫和中午高溫對(duì)短柄山茶花粉萌發(fā)的的影響。上述試驗(yàn)培養(yǎng)基為0.292 mol/L蔗糖，8 g/L瓊脂，pH 5.5～6.0。

統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率時(shí)，每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)觀測(cè)100?；ǚ垡陨?。花粉管長(zhǎng)度大于花粉粒直徑作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)?；ǚ勖劝l(fā)率（%）=萌發(fā)花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100%，取平均值作為花粉萌發(fā)率。

1.2.2 花粉貯藏力測(cè)定

將-80℃超低溫冰箱保存0、3、6、9和12個(gè)月的花粉，取部分花粉按上述適宜條件進(jìn)行萌發(fā)率測(cè)定。

1.2.3 顯微觀察

花粉萌發(fā)觀察采用ZEISS正置顯微鏡（Axio Scope A1，德國(guó)）。使用AxioVision軟件進(jìn)行圖像捕捉和保存。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法

使用 SAS V8.02軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan's （1955） 多重比較法進(jìn)行差異顯著性測(cè)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜糖類(lèi)的篩選

濃度為0.292 mol/L（即100 g /L蔗糖當(dāng)量）的不同糖類(lèi)對(duì)短柄細(xì)葉連蕊茶花粉萌發(fā)率的影響，見(jiàn)圖1～2。結(jié)果表明，以蔗糖和乳糖為碳源時(shí)，花粉萌發(fā)率最高達(dá)16.17%和16.08%；無(wú)糖和葡萄糖培養(yǎng)基次之，分別為10.39%和9.52%；山梨醇再次之，麥芽糖最次，萌發(fā)率僅有3.03%。最高組、次之組和最次之組之間差異顯著，即蔗糖和乳糖均是最適宜花粉萌發(fā)的碳源供給者。

2.2 適宜糖濃度的篩選

培養(yǎng)基中蔗糖濃度對(duì)短柄細(xì)葉連蕊茶花粉萌發(fā)率的影響，見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，隨著蔗糖濃度升高，花粉萌發(fā)率先升高后降低，其中當(dāng)蔗糖濃度為0.292 mol/L時(shí)，花粉萌發(fā)率最高達(dá)16.17%；當(dāng)蔗糖濃度升高到0.876 mol/L時(shí)，花粉萌發(fā)受到顯著抑制，萌發(fā)率僅為3.26%，顯著低于對(duì)照。顯微鏡觀察結(jié)果也證實(shí)，當(dāng)蔗糖濃度為0.292 mol/L時(shí)，花粉萌發(fā)率最高（圖4）。因此，最適宜花粉萌發(fā)的蔗糖濃度為0.292 mol/L，即100 g/L。

2.3 低溫或高溫對(duì)花粉萌發(fā)的影響

本試驗(yàn)?zāi)M華南地區(qū)冬春季溫度，對(duì)花粉培養(yǎng)分為2個(gè)階段，研究了第一階段的高溫或低溫對(duì)短柄細(xì)葉連蕊茶花粉萌發(fā)率的影響（圖5～6）。結(jié)果表明，將花粉置于5～25℃環(huán)境中培養(yǎng)6 h后，再恢復(fù)培養(yǎng)18 h，花粉萌發(fā)率較高，分別為16.47%、16.59%、15.79%、16.54%和16.17%，差異不顯著。隨著第一階段處理溫度的升高，花粉萌發(fā)率顯著降低，當(dāng)處理溫度為30℃時(shí)，花粉萌發(fā)率降為10.20%；當(dāng)處理溫度升高到35℃時(shí)，花粉萌發(fā)率進(jìn)一步降低，僅為1.85%。因此，證實(shí)低溫對(duì)花粉的萌發(fā)沒(méi)有不良影響。

2.4 -80℃貯藏時(shí)間對(duì)花粉萌發(fā)的影響

花粉-80℃貯藏試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖7，花粉保存前萌發(fā)率為16.17%；貯藏3個(gè)月后，萌發(fā)率為15.57%，但與新鮮花粉萌發(fā)率差異不顯著；隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，花粉萌發(fā)率有所下降，貯藏6個(gè)月后，花粉萌發(fā)率降為12.97%；貯藏9個(gè)月后，花粉萌發(fā)率為11.73%；貯藏12個(gè)月后，花粉萌發(fā)率仍然達(dá)11.12%，與貯藏6個(gè)月后的萌發(fā)率差異不顯著。

3 討論

花粉萌發(fā)時(shí)需要能量物質(zhì)，花粉自身會(huì)貯藏一些淀粉等糖類(lèi)物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠促進(jìn)花粉在適宜條件下啟動(dòng)萌發(fā)。隨著花粉管的伸長(zhǎng)，外源的糖類(lèi)物質(zhì)將會(huì)影響花粉管的生長(zhǎng)。花粉培養(yǎng)使用較為普遍的是蔗糖。本研究結(jié)果表明，蔗糖與乳糖能較好地促進(jìn)短柄細(xì)葉連蕊茶花粉萌發(fā)，效果差異不顯著；葡萄糖濃度為0.292 mol/L時(shí)，促進(jìn)花粉萌發(fā)效果次之；無(wú)糖或山梨醇再次之；麥芽糖最差。前人相似的研究結(jié)果表明，蔗糖比果糖和甘露醇更能促進(jìn)櫻桃花粉的萌發(fā)[5]；在野生龍蒿萌發(fā)試驗(yàn)中，蔗糖優(yōu)于麥芽糖和葡萄糖[6]。但也有不同結(jié)論，陳暄等對(duì)茶樹(shù)花粉萌發(fā)的研究表明，麥芽糖優(yōu)于蔗糖[7]；安國(guó)寧等對(duì)桃樹(shù)花粉萌發(fā)的研究則發(fā)現(xiàn)，葡萄糖優(yōu)于蔗糖[8]；許珂等對(duì)金銀忍冬花粉萌發(fā)的研究則表明，乳糖優(yōu)于葡萄糖、蔗糖和果糖[9]。因此，在進(jìn)行某個(gè)物種花粉培養(yǎng)時(shí)，要先試驗(yàn)才能確定適宜的炭源。值得一提的是，濃度為0.292 mol/L的無(wú)糖或葡萄糖促進(jìn)花粉萌發(fā)的效果差異不顯著，表明作為炭源，此濃度的葡萄糖對(duì)短柄細(xì)葉連蕊茶花粉萌發(fā)促進(jìn)效果不明顯；試驗(yàn)中濃度為0.292 mol/L的麥芽糖培養(yǎng)基上的花粉萌發(fā)率還不及無(wú)糖培養(yǎng)基，表明麥芽糖不僅沒(méi)有促進(jìn)作用，還嚴(yán)重抑制了花粉的萌發(fā)。

糖不僅提供花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)所需的能量，其適宜的濃度也能夠維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡。前人研究結(jié)果表明，山茶屬多個(gè)物種如連蕊茶[3-4]、油茶[10]、紅山茶[11-14]、金花茶[15]、茶樹(shù)[7，16]的花粉體外萌發(fā)所需適宜蔗糖濃度在5%～20%（0.146～0.586 mol/L），其中川鄂連蕊茶為20%，毛柄連蕊茶為10%。本研究表明，短柄細(xì)葉連蕊茶花粉體外萌發(fā)所需適宜蔗糖濃度為10%。因此，進(jìn)行連蕊茶組物種的花粉培養(yǎng)試驗(yàn)時(shí)，也要先試驗(yàn)適宜的糖濃度。

溫度對(duì)花粉萌發(fā)至關(guān)重要。許多植物花粉萌發(fā)的適宜溫度在20～28℃[15-17]；但一些植物花粉適宜萌發(fā)溫度較高，達(dá)30℃[18-19]；而有的植物花粉萌發(fā)適宜溫度較低，僅為10℃[20]，超過(guò)適宜溫度的范圍，花粉萌發(fā)就會(huì)受到不同程度的抑制。本試驗(yàn)?zāi)M華南地區(qū)冬春季溫度，對(duì)花粉培養(yǎng)分為2個(gè)階段，第一階段設(shè)置了7種溫度，培養(yǎng)6 h后，再轉(zhuǎn)移至25℃恢復(fù)培養(yǎng)，主要目的是為了研究第一階段的高溫或低溫對(duì)長(zhǎng)柄山茶花粉萌發(fā)率的影響。結(jié)果表明，第一階段5～25℃的培養(yǎng)，花粉萌發(fā)率較高，且差異不顯著，表明低溫對(duì)花粉萌發(fā)率沒(méi)有不良影響。而第一階段培養(yǎng)溫度達(dá)到30～35℃，花粉萌發(fā)率明顯降低。因此，在華南地區(qū)冬春季進(jìn)行茶花雜交授粉時(shí)，不必?fù)?dān)心夜間低溫對(duì)花粉萌發(fā)的影響；但要充分考慮中午高溫對(duì)花粉萌發(fā)的影響。

花粉保存通常分為冷藏（4～5℃）、低溫（-80～-20℃）和超低溫（液氮-196℃）保存等幾種方式。一般來(lái)說(shuō)，冷藏保存可短期內(nèi)保持花粉活力[3]；低溫保存可較長(zhǎng)時(shí)間保持花粉活力[21-22]；超低溫保持可長(zhǎng)期保持花粉活力[23]，但成本較高。本研究在-80℃保存1年后，短柄細(xì)葉連蕊茶的花粉萌發(fā)率仍然達(dá)到10%以上，可以解決花期不遇的問(wèn)題，滿(mǎn)足雜交授粉對(duì)花粉活力的需求。

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