咖啡樹咖啡堿合成相關基因研究進展

李梅 徐丹旎 李麗江 尚衛瓊 李旸 尚宇梅

摘 要 咖啡是世界三大飲料之一，其含有的咖啡堿，適量攝入對身體有益，過多則有害。因此，培育低咖啡堿或無咖啡堿咖啡品種具有非常重要的意義。目前，已從多數植物中分離并克隆出咖啡堿合成的相關基因，并研究了其表達特點和相關酶活性的調節機制，探討培育低咖啡堿咖啡樹的可能途徑和存在的問題。綜述近年來咖啡樹咖啡堿合成與代謝的研究進展，展望如何培育出生長快、成本低、安全穩定的低咖啡堿植株，從而實現農業推廣。

關鍵詞 咖啡樹 ；咖啡堿 ；基因

中圖分類號 S571.2 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.09.009

Abstract Coffee was one of the three major beverages in the world. Coffee contains caffeine， and is good to the health when taken adequately but harmful when taken too much. It is， therefore， very important to breed low caffeine or caffeine-free coffee varieties. The genes related to caffeine synthesis had been isolated and cloned from most of plants， and their expression and regulatory mechanisms underlying the activities of related enzymes had been analyzed. The problems and ways of breeding low caffeine or caffeine-free coffee varieties were discussed. The research progress of caffeine synthesis and metabolism in recent years were reviewed， based on which a prospect was made for breeding and extension of low caffeine coffee varieties with fast growth， low cost， safety and stability.

Keywords coffee tree ； caffeine ； genes

咖啡是重要的熱帶經濟作物，是世界三大飲料之一，在國際貿易、熱帶農業經濟和人類生活中具有重要作用。咖啡為茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（Coffea genus）植物，該屬植物共100多種，主要分為四倍體和二倍體[1]。目前，主要種植的有小粒種（Coffee arabica）、中粒種（Coffee robusta）和大粒種（Coffee liberica）[2-4]。小粒咖啡的大多數品種中，咖啡豆中咖啡堿含量約為1.0%，中粒咖啡為1.7%，大粒咖啡為1.4%[5]。其中，小粒種咖啡品質較好，種植面積大，其產量占全球咖啡產量的73%。目前，小粒咖啡較為常見的品種有波邦（Bourbon）、鐵畢卡（Typica）、卡杜拉（Caturra）、卡蒂姆（Catimor）、卡杜艾（Catuai）等[2]。近年來，小粒種咖啡生產規模不斷擴大，產業發展迅速，已成為很多地區獨具優勢的特色經濟和支撐產業。國內越來越多的人接受并飲用咖啡，咖啡含有咖啡堿，適量攝入對身體有益，過多則有害。在小粒咖啡中，咖啡堿的合成部位主要在葉片和鮮果中，幼苗的葉片和子葉含有咖啡堿，而根部和成熟枝條中幾乎不含有咖啡堿[6]。

咖啡堿（Caffeine）又稱咖啡因或甲基可可堿，是一種黃嘌呤生物堿化合物，其化學名為1，3，7-三甲基黃嘌呤，化學式為C8H10N4O2[7]。植物中，咖啡堿的合成代謝途徑主要分為4步反應，包括3次由甲基轉移酶催化進行的甲基化反應和1次由核糖核苷水解酶催化進行的脫核糖反應[8]。目前，從咖啡樹中，已克隆得到 3 個咖啡堿合成的關鍵酶基因，分別為咖啡7-黃嘌呤核苷甲基轉移酶（7-Methylxanthosine Synthase，CaXMTT1）[9]，咖啡堿合成酶基因（Coffee Caffeine Synthase，CaDXMT1）[10]和雙功能酶基因（Bifunctional Coffeee Coffeine Synthase，CCS1）[11]。但是目前對小粒咖啡樹不同部位中CaXMT1、CaDXMT1、CCS1基因表達量差異，以及這3個關鍵基因的表達與咖啡堿含量關系的研究尚無報道。

1 咖啡堿的作用

咖啡堿存在于許多植物中，人類最常食用的有咖啡、茶及可可等。咖啡堿是一種中樞神經興奮劑，適度攝入可以興奮神經中樞，提高反應速度、集中注意力和消除疲勞[12-14]；能夠促進胰島素分泌和降低Ⅱ型糖尿病風險，刺激呼吸系統，用于治療早產嬰兒呼吸暫停[15-17]。攝入過量的咖啡堿，會對人體產生負作用，使人體對其產生依賴性或成癮，引起機體功能失調，甚至引發各種疾病。研究表明，攝入高劑量的咖啡堿會影響睡眠、刺激中樞神經、提高類風濕關節炎的患病率、增高血壓以及引起孕婦嬰兒早產等現象[18-20]。由于以上這些咖啡堿的負面作用，國內及國際市場上，都希望有低咖啡堿或無咖啡堿的咖啡和咖啡飲品。近年來，咖啡生產商都在努力的降低和去除咖啡中的咖啡堿，但去除咖啡堿的同時，又保證其它成分完好無缺是一個非常大的挑戰。市場上諸多去除咖啡咖啡堿的方法，不僅破壞了咖啡原有的風味，而且成本較高，但脫咖啡堿咖啡每年的市值仍然高達20億美元。

2 咖啡堿的合成途徑

20世紀60年代至70年代初，通過放射性標記的研究，觀察咖啡組織中的轉移動態，初步確定可可堿（theobromine， 3，7-二甲基黃嘌呤，Tb）是咖啡堿合成的直接前體物質。在咖啡樹葉片中，7-甲基黃嘌呤核苷（7-methylxanthosine， 7mXR）的放射性能轉移到咖啡堿中。Suzuki等[21]在咖啡樹愈傷組織提取物中檢測到N-核苷水解酶和N-甲基轉移酶活性，證明了合成咖啡堿的前體是7mXR。研究利用RACE技術和探針篩選法等，一系列咖啡堿合成酶基因分別被克隆出，包括咖啡7-黃嘌呤核苷甲基轉移酶（7-Methylxanthosine Synthase， CaXMT1），可可堿合成酶基因（Coffee Theobromine Synthase，CaMXMT1）、CaMXMT2，咖啡堿合成酶基因（Coffee Caffeine Synthase， CaDXMT1）和雙功能酶基因（Bifunctional Coffee Coffeine Synthase， CCS1）等[9-11]。雖然以上酶的氨基酸序列相似性達80%以上，但底物專一性的差異卻較大。2007年，法國學者克隆到中果咖啡（Coffea canephora）的N-甲基轉移酶CcXMT1和CcDXMT1基因，通過在大腸桿菌中表達并進一步純化結晶，最后通過X射線衍射等方法，分析得到三維結構[22]。但是目前對小粒咖啡樹不同部位中CaXMT1、CaDXMT1、CCS1基因表達量差異，以及這3個關鍵基因的表達與咖啡堿含量關系的研究尚無報道。

植物中，咖啡堿的合成代謝途徑主要分為4步反應，包括：1次核糖核苷水解酶催化進行的脫核糖反應，3次甲基轉移酶催化進行的甲基化反應。具體合成途徑為：腺嘌呤→腺苷酸（AMP）→次黃嘌呤核苷酸（IMP）→黃嘌呤核苷酸（XMP）→黃嘌呤核苷（XR）→7-甲基黃嘌呤核苷（7mXR）→7-甲基黃嘌呤（7-MX）→可可堿（3，7-二甲基黃嘌呤）→咖啡堿（1，3，7-三甲基黃嘌呤，Cf）[22]。N-甲基轉移酶（N-Methyltransferase，NMT）是催化三步轉甲基反應的關鍵[23-24]。

咖啡堿合成途徑中以黃嘌呤核苷為底物，生成7-甲基黃嘌呤核苷，是第一步反應。Uefuji等[9]從咖啡中克隆出編碼7mXR合成酶的cDNA序列，命名為 CaXMT1。根據McCarthy等[20]關于蛋白酶化學結構的研究發現，咖啡中的 CaXMT1 極有可能具有雙重作用，同時催化黃嘌呤核苷進行了7-甲基轉移以及核糖消解作用。

咖啡堿合成第二步反應的關鍵酶為：催化7mXR反應生成7-MX的核糖核苷水解酶。Negishi等[25]從茶葉粗酶中初步分離出茶樹的核糖核苷水解酶，該酶在水解7-甲基黃嘌呤核苷時，所產生的D-核糖其5′-末端未被磷酸化，證明不是核苷磷酸化酶。盡管研究已檢測到茶樹中核糖核苷水解酶的生物活性，但目前有關該酶的具體蛋白表達及功能鑒定，不管在咖啡、茶葉還是其它植物中，尚無任何報道。

咖啡堿合成途徑的最后兩步反應，同樣由甲基轉移酶催化完成。在茶樹中，Kato等[26]分離得到咖啡堿合酶（Caffeine Synthase， CS）；之后應用RACE方法，克隆出咖啡堿合成酶基因，全長為1 438 bp，正式命名為茶樹咖啡堿合酶（Tea Caffeine Synthase，TCS）基因TCS1[27]，隨后研究證實，TCS1具有可可堿合成酶和咖啡堿合成酶的雙重作用。基于茶樹TCS1的序列信息，在咖啡中，已克隆成功編碼咖啡堿合成酶的基因CaDXMT1和CCS1，其中CCS1的活性與TCS1很相似。

此外，茶樹中的次黃嘌呤核苷酸脫氫酶（Inosine 5′-Monophosphate Dehydrogenase；IMPDH）催化IMP合成XMP[28]，其cDNA全長序列被克隆，命名為TIDH。茶樹中S-腺苷甲硫氨酸（SAM）合成酶基因（SAMs）也已被克隆，序列全長1 303 bp，編碼394個氨基酸[29]。SAMS催化甲硫氨酸和ATP生成SAM，而SAM是茶樹咖啡堿合成的唯一甲基供體。

Keya等[30]利用IMPDH抑制劑三氮唑核苷（ribavirin）降低了咖啡葉片中咖啡堿和可可堿的含量。Ogita等[31]通過利用 RNA 干擾技術，抑制咖啡植株中可可堿合成酶基因 CaMXMT1的表達，從而獲得了低咖啡堿含量和低可可堿含量的轉基因咖啡樹。

Denoeud等[32]獲取了中粒種咖啡的基因組草圖，鑒別出中粒種咖啡基因組中合成超過 25 000 種蛋白質的基因。并且研究者還找到了使咖啡樹中咖啡堿的含量高于其它植物的基因家族。研究人員發現，這些基因編碼了甲基轉移酶，從而在基因表達的過程中，增加甲基團，從而將一種黃嘌呤核苷分子轉化為咖啡堿。此外，咖啡植株中與咖啡堿合成途徑有關的酶，與茶樹和可可植株合成途徑中的酶并不相似，這說明三者合成咖啡堿的途徑可能是獨自演化而成。此外，與其它植物相比，咖啡植株的基因更易生成與咖啡的香味和苦味等密切相關的類黃酮和生物堿這2種物質。

3 培育低咖啡堿咖啡樹品種的展望

研究人員在非洲發現了咖啡因含量僅為0.07%的咖啡樹，該咖啡樹缺少合成咖啡因所需的酶。但其生長速度比普通咖啡樹品種慢30%左右。研究人員希望將它與普通咖啡樹品種雜交來提高其生長速度，希望最終能培育出生長快、成本低、能大量生產上述咖啡豆的咖啡樹。研究者利用RNA干擾技術，抑制了轉基因胚胎細胞和植株幼苗中相關基因的表達，從而降低了其可可堿和咖啡堿的含量。此外，目前對于咖啡堿合成途徑中相關基因表達特點，以及相關酶活性的調節機制已有相關報道，但其內在調控機制還處于未知狀態，仍需新的研究手段和方法，同時，需要對其穩定性、安全性以及經濟價值做出評價。

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