H2 O2 誘導ARPE-19細胞損傷模型的建立及藍莓花青素的保護作用

吳 寒， HUTABARAT Ruth Paulina， 黃午陽

(江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014)

年齡相關性黃斑病變 (age-related macular degeneration, AMD) 是一種隨年齡增長出現的視網膜黃斑部退行性病變，是發達國家最常見的不可逆性致盲眼病。在我國，50歲以上人群中，AMD是最重要的致盲性疾病之一[1]。一般認為，AMD的發病機制涉及老化、氧化損傷、炎癥、自身免疫等多種途徑，視網膜色素上皮 (retinal pigment epithelial, RPE) 細胞是其病理改變各階段的中心環節，長期氧化應激導致的RPE結構與功能異常被認為是引發AMD的重要原因[2]。作為眼部組織細胞代謝最活躍的細胞，RPE可以吞噬視網膜光感受器細胞的外界盤膜，產生大量的脂質過氧化物及H2O2[3]。因此，對RPE氧化應激損傷和保護進行研究，將有利于深入探索AMD的發病機制和治療手段。

近年來，花青素保護視力研究受到了廣泛關注，研究者認為花青素能夠促進視網膜紫質合成、減輕氧化應激誘導的視網膜細胞損害[4]。前期研究時，本課題組從兔眼藍莓 (Vacciniumashei) 中提取花青素，經高效液相色譜 (high performance liquid chromatography, HPLC) 和HPLC-DAD-MS聯用技術分析，含有9種花色苷組分[5]，依次為錦葵色素-3-半乳糖苷 (malvidin-3-galactoside, Mv-3-gal)、錦葵色素-3-葡萄糖苷 (malvidin-3-glucoside, Mv-3-glc)、牽牛花色素-3-半乳糖苷 (petunidin-3-galactoside, Pt-3-gal)、牽牛花色素-3-葡萄糖苷 (petunidin-3-glucoside, Pt-3-glc)、矢車菊素-3-半乳糖苷 (cyanidin-3-galactoside, Cy-3-gal)、飛燕草素-3-半乳糖苷 (delphindin-3-galactoside, Dp-3-gal)、飛燕草素-3-葡萄糖苷 (delphindin-3-glucoside, Dp-3-glc)、芍藥素-3-半乳糖苷 (peonidin-3-galactoside, Pn-3-gal) 和錦葵色素-3-阿拉伯糖苷 (malvidin-3-arabinose, Mv-3-ara)，其中Mv-3-gal和Mv-3-glc兩者之和約占花青素總含量的46%。可見藍莓中的花青素、錦葵色素含量豐富，為主導成分。目前，關于藍莓花青素錦葵色素對于視網膜內皮細胞氧化損傷的保護作用的報道十分罕見，鑒于研究必要性，本文選擇自由基引起老化理論的主要因素——H2O2作為誘導劑，建立ARPE-19細胞損傷模型，用于探究藍莓花青素錦葵色素的保護作用。

1 材料與方法

1.1細胞株、藥物與試劑人視網膜色素上皮細胞系 (ARPE-19)，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。兔眼藍莓， 2016年6月摘于南京市溧水藍莓種植基地，-18℃凍存；錦葵色素 (Mv)、錦葵色素-3-葡萄糖苷 (Mv-3-glc)、錦葵色素-3-半乳糖苷 (Mv-3-gal)、胰蛋白酶，購自美國Sigma Aldrich公司；胎牛血清、DMEM培養基 (含5.5 mmol·L-1葡萄糖)，購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素，購自上海Life Technologies公司；活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 檢測試劑盒、MTT細胞增殖檢測試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2儀器Airtech超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；CO2細胞培養箱，美國Thermo公司； TDZ5-WS水平離心機，上海滬湘儀器有限公司；3K15離心機，德國Sigma公司；電子分析天平，上海精密科學儀器有限公司；Eyela FDU-1200凍干機，日本Tokyo Rikakikai公司；Synergy H4微孔板式多功能分析儀 (配有Hyper Terminal Applet ELISA軟件)，美國Bio Tek公司；DS-Ri2/ECLIPSE Ti-S倒置成像顯微鏡，日本Nikon公司。

1.3方法

1.3.1藍莓花青素提取[5]稱取250 g凍存藍莓，室溫下解凍并打漿，加入1 L含有1% HCl的甲醇溶液，浸提花青素24 h，每隔2 h混勻1次。浸提液在4℃、5 000×g條件下離心15 min，去除沉淀，40℃旋轉蒸發，按1 ∶1 (V∶V) 比例加入乙酸乙酯，萃取3次。用AB-8型大孔樹脂純化花青素粗提物，之后凍干，得到藍莓花青素提取物 (blueberry anthocyanin extract, BAE) 粉末。

1.3.2ARPE-19細胞培養[6]從液氮中取出ARPE-19凍存管，放于37℃水浴，盡快搖晃解凍，轉移凍存液至離心管，25℃、1 000×g離心5 min，棄上清，除去DMSO。用含有10% (V/V) 胎牛血清、1% (V/V) 青鏈霉素的DMEM培養基在37℃、5% CO2培養箱中復蘇細胞，再用0.25%胰酶進行消化，細胞計數、傳代。選擇生長良好的3～4代細胞，待細胞長至80%～90%融合時，用于實驗。

1.3.3ARPE-19處理

1.3.3.1H2O2誘導ARPE-19細胞損傷的條件 選擇濃度為0、10、40、80、100、200、400、800、1 600、3 200 μmol·L-1H2O2，分別誘導ARPE-19細胞2、6、24 h，篩選出H2O2刺激的最佳濃度和時間。

1.3.3.2BAE對ARPE-19細胞的毒性實驗 根據上述結果，選擇濃度為0、1、5、10 mg·L-1BAE，分別處理ARPE-19細胞6、24 h，確定在該濃度范圍內、處理時間下BAE對細胞的毒性。

1.3.3.3BAE對H2O2誘導ARPE-19細胞損傷模型的保護 設立分組：未加入任何藥物的細胞為空白組；只加入H2O2的細胞為誘導組；BAE預處理后，再加入H2O2的細胞為保護組。以上分組中，BAE濃度為1、5、10 mg·L-1，保護時間為6、24 h；H2O2濃度為800 μmol·L-1，刺激時間為2、24 h。確定H2O2和BAE的處理時間，以及BAE用量。

1.3.3.4比較錦葵色素對H2O2誘導ARPE-19細胞損傷的保護作用 按“1.3.3.3”設立分組，比較BAE、Mv、Mv-3-glc和Mv-3-gal的保護作用。錦葵色素濃度為5 mg·L-1，保護時間為6 h；H2O2濃度為800 μmol·L-1，刺激時間為2 h。

1.3.4細胞活力測定[7]采用MTT法測定細胞活力。收集細胞，制備濃度為1×109·L-1細胞懸浮液，每孔接種100 μL于96孔板，37℃、5% CO2培養，待細胞長滿孔底時，棄去培養液，換無血清培養基培養4 h，使細胞處于同步生長狀態。按照“1.3.3”處理細胞。每孔加入5 g·L-1MTT溶液10 μL，繼續培養4 h，之后棄去孔內溶液。各加入100 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，使紫色結晶物充分溶解，測定490 nm處的吸光度 (Abs) 值。以“1.3.3”中未加入任何藥物的細胞為空白對照，按下式計算ARPE-19細胞活力。

細胞活力=實驗組Abs值/對照組Abs值×100%

1.3.5細胞中ROS水平測定[8]采用免疫熒光法測定細胞ROS水平。收集細胞，制備濃度為1×109·L-1細胞懸浮液，每孔接種2 mL于6孔板中，37℃、5% CO2培養，待細胞長滿孔底時，棄去培養液，換無血清培養基培養4 h，使細胞處于同步生長狀態。按照“1.3.3.4”處理細胞。棄去上清液，在無菌條件下裝載DCFH-DA探針，濃度為10 μmol·L-1，于37℃細胞培養箱孵育20 min。用磷酸鹽緩沖液 (PBS) 洗滌細胞3次，充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。用1 mL PBS收集消化后的細胞，放入酶標儀中，在激發波長485 nm、發射波長535 nm條件下檢測熒光強度。ROS水平以熒光強度值 (arbitrary unit, A.U.) 表示，“1.3.3.4”中未加入任何藥物的細胞為空白對照，按下式計算ARPE-19細胞中ROS相對含量。

ROS相對含量=實驗組A.U.值/對照組A.U.值×100%

2 結果

2.1H2O2誘導ARPE-19細胞損傷模型Tab 1為不同濃度、不同處理時間下，H2O2對ARPE-19細胞存活率的影響。結果表明，隨著H2O2濃度的增大，活細胞數量明顯下降，并呈現劑量依賴效應，H2O2濃度越大，細胞損傷越嚴重，測得的存活率依次降低。通常選擇存活率為50%～60%時的損傷劑濃度為最佳誘導濃度，當H2O2濃度為800 μmol·L-1，刺激時間為2 h或24 h時，ARPE-19細胞存活率為62.51%和59.99%，接近該范圍，因此選擇該條件進行誘導。

Tab 1 Effects of different concentrations and stimulatedtime of H2O2 on cell viability

*P<0.05,**P<0.01vsgroup without H2O2in each stimulated time

2.2BAE對ARPE-19細胞的毒性檢測MTT法測定不同濃度BAE作用細胞6、24 h后，細胞存活率的變化情況。由Tab 2可以看出，0～10 mg·L-1的BAE作用ARPE-19細胞后，細胞存活率與未加樣品的空白對照組相比無明顯減少，在不同處理時間下，細胞的存活率差異也無顯著性，甚至5 mg·L-1BAE預處理6 h可以改善細胞生長，提高存活率 (P<0.01)。結果表明，在所選濃度范圍內，花青素對ARPE-19細胞生長無毒性，是其發揮對細胞損傷保護作用的前提。

Tab 2 Effects of different concentrations and mediatedtime of BAE on cell viability

**P<0.01vsgroup without BAE in each mediated time

2.3BAE對H2O2誘導ARPE-19細胞損傷模型的保護作用如Fig 1所示，1、5、10 mg·L-1BAE預處理ARPE-19細胞6 h (模型A)和24 h (模型B)，分別以800 μmol·L-1H2O2再刺激2 h (模型A) 和24 h (模型B)，處理后的細胞較未加入BAE保護的細胞在存活率上有明顯區別。模型A中，H2O2誘導使細胞存活率降低38.50% (P<0.01)，經5、10 mg·L-1BAE保護后，細胞存活率明顯提高，分別達到86.57% (P<0.01) 和76.59% (P<0.05)；模型B中，H2O2誘導使細胞存活率降低23.10% (P<0.01)，但1～10 mg·L-1BAE對ARPE-19細胞的保護作用不明顯，可能是由于長時間的損傷難以修復。因此，以藍莓花青素濃度5 mg·L-1，預處理時間6 h；H2O2刺激濃度800 μmol·L-1，刺激時間2 h作為條件，進一步探究藍莓花青素主成分錦葵色素及其糖苷對H2O2誘導ARPE-19細胞損傷的保護作用。

Fig 1 Effects of different treatments on growth of ARPE-19

Model A:Cells were incubated in BAE for 6 h, and then 800 μmol·L-1H2O2for 2 h; Model B: cells were incubated in BAE for 24 h, and then 800 μmol·L-1H2O2for 24 h.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group without BAE and H2O2;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group without BAE.

2.4錦葵色素對H2O2誘導ARPE-19細胞損傷模型的保護作用根據上述結果建立H2O2誘導ARPE-19細胞氧化損傷模型，比較BAE、Mv、Mv-3-glc和Mv-3-gal對細胞的保護作用，采用MTT法和免疫熒光法分別測定ARPE-19細胞的存活率及ROS水平。如Fig 2A所示，800 μmol·L-1H2O2刺激2 h后，細胞存活率明顯下降36.31% (P<0.01)，藍莓花青素提取物和錦葵色素可以明顯抑制細胞氧化損傷，提高ARPE-19細胞存活率。5 mg·L-1BAE、Mv、Mv-3-gal和Mv-3-glc預處理6 h后，細胞存活率分別達到86.57%、115.72%、98.15%和127.97%，其中錦葵色素糖苷 (Mv-3-glc、Mv-3-gal) 的保護作用比BAE和Mv更為明顯。由于高濃度H2O2可以誘導產生氧化應激，ARPE-19細胞在800 μmol·L-1H2O2刺激下的ROS水平明顯高于對照組 (P<0.01)，見Fig 2B。經過5 mg·L-1藍莓花青素預處理，BAE、Mv、Mv-3-gal和Mv-3-glc對H2O2誘導產生的ROS分別抑制26.66%、48.56%、39.47%和 58.04%。花青素錦葵色素及其糖苷對氧化應激下產生ROS的抑制作用 (P<0.01) 比藍莓花青素提取物更為明顯 (P<0.05)，Mv-3-gal使細胞中ROS水平甚至低于空白對照組 (P<0.05)，其抗氧化能力最強，說明錦葵色素及其糖苷是藍莓花青素提取物中發揮抗氧化損傷的主要物質。

Fig 2 Effects of different treatments on growthand ROS level of ARPE-19

A:Cell viability; B: ROS relative content.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group without BAE and H2O2;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group without BAE.

3 討論

花青素是迄今為止發現的最有效的天然水溶性自由基清除劑，其淬滅超氧陰離子自由基的能力是維生素C的20倍、維生素E的50倍。通過動物實驗發現，花青素可以穿過血-腦水屏障和血-視網膜屏障被眼組織吸收，并以完整的形式存在[9]。之前研究表明，藍莓中的花青素含量在各類水果蔬菜中排名第1，兔眼藍莓中錦葵色素含量占花青素總量最多，主要以葡萄糖苷和半乳糖苷形式存在[5]。根據相關報道，在H2O2誘導RPE細胞氧化損傷過程中，從細胞膜出泡到細胞凋亡，以及RPE細胞連接遭到破壞，誘發了一系列病理反應，這一氧化應激過程參與了許多嚴重眼底疾病 (如老年性黃斑變性、視網膜靜脈阻塞等) 的發病[2-3]。因此，作為活性氧中間產物之一，H2O2常被用于誘導RPE細胞的氧化損傷。本文研究了不同濃度H2O2、不同刺激時間對ARPE-19細胞活力的影響，確定最佳H2O2用量和時效，構建了RPE細胞損傷模型，并初步探討了藍莓花青素粗提物以及其主要成分錦葵色素、錦葵色素-3-葡萄糖苷、錦葵色素-3-半乳糖苷對RPE細胞的保護及減緩氧化損傷的作用。

結果表明，藍莓花青素可以抑制H2O2誘導的ARPE-19細胞損傷，減少細胞內氧自由基，提高細胞存活率。這與花青素以下幾方面的作用十分相關[10-11]：① 有效清除誘發脂質過氧化反應的羥自由基及反應中間產物脂質過氧化自由基、烷自由基，阻斷自由基鏈式反應；② 激活視網膜酶，活化和促進視紅素的再合成；③ 調節視網膜血液微循環、加速物質代謝交換，加強對毛細血管的保護作用。此外，Milbury等[12]從越橘中提取花青素及其他酚類物質，對RPE細胞進行預處理，之后進行氧化損傷實驗，發現越橘花青素提取物可以上調抗氧化酶HO-1和GST-pi的表達，使細胞損傷程度明顯小于對照組。張震等[13]采用1 mmol·L-1H2O2誘導BGC-823細胞，比較藍莓花青素預處理對細胞氧化損傷的影響，表明6.25～100 mg·L-1藍莓花青素提取物能夠明顯提高BGC-823細胞的存活率，抑制細胞中ROS生成，對H2O2誘導的細胞損傷起到保護作用。

ROS是生物體內重要的生物信號傳導介質，廣泛參與各種正常生理和病理過程。本研究中，H2O2誘導產生過多或無法迅速消除的ROS，使RPE細胞處于氧化應激狀態，導致了機體中蛋白質破碎、DNA損傷和脂質過氧化。研究表明，花青素可以通過提高超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶 (catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶 (glutathione peroxidase, GSH-Px)等體內抗氧化酶活力，降低細胞中的ROS水平[14]。Teng等[15]還證明，飛燕草素、矢車菊素和天竺葵素的花色苷能夠阻斷MAPKs相關通路，如ERK1/2和p38MAPK信號通路，以及使Akt磷酸化，促進Akt信號通路中p-Akt/Akt增加，使細胞內抗氧化酶的表達上調，從而減少ROS水平。本文發現的藍莓花青素對視網膜細胞的保護作用，證實了藍莓護眼和預防眼科疾病的功能，為研究藍莓花青素預防氧化應激引起的AMD作用機制提供了基礎，明確了視網膜病變治療的新方向。下一步我們還將繼續探究藍莓花青素錦葵色素對不同內源性抗氧化酶活力的影響，以及是如何通過調控MAPKs和Akt信號通路發揮保護作用的，進一步闡明藍莓花青素對RPE細胞抗氧化損傷的保護機制。

(致謝：本文實驗在江蘇省農產品工程技術研究中心平臺及實驗室同學協助下完成，在此表示感謝。)

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