DCE-MRI評估索拉非尼抑制兔VX2肝種植瘤血管生成的實驗研究

潘江洋， 時高峰， 王琦， 王麗佳， 張寧， 黃寧

近年來，抗腫瘤血管生成治療成為研究的熱點，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與受體結合后，能有效誘導血管內皮細胞增生，促進腫瘤血管的形成，并為侵襲周圍組織和轉移提供基礎。索拉非尼是一種多激酶抑制劑，通過抑制Raf-MEK-ERK信號轉導通路及細胞表面激酶受體，如內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)和血小板衍生因子受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)等，從分子水平阻斷腫瘤新生血管的形成，是肝癌治療的新選擇[1]?？寡苌芍委熓鼓[瘤缺血壞死，在治療早期腫瘤的大小變化往往不明顯，缺乏有效的影像評估手段。MR動態增強掃描成像(dynamic contrast enhanced MRI,DCE-MRI)在提供常規MR圖像的同時，還可提供腫瘤組織內部血流灌注信息，常用于腫瘤療效的評估[2]。本研究以兔VX2肝種植瘤為實驗模型，該模型腫瘤血供豐富，旨在探討DCE-MRI定量參數評估索拉非尼抑制血管生成的能力。

材料與方法

1.兔VX2肝種植瘤模型制作

兔VX2瘤株購自東南大學實驗動物中心。實驗動物為健康新西蘭大白兔45只，體重(3.2±0.5) kg/只，雌雄不限，普通級，均購自河北醫科大學實驗動物中心。新西蘭大白兔由單個兔籠飼養，用衛生水及標準兔飼料喂養。術前禁食12 h，剝離荷瘤兔腫瘤，切取生長旺盛的魚肉樣組織，制成體積為1 mm3的瘤組織塊備用，采用1%戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg)經兔耳緣靜脈注射進行麻醉，麻醉成功后，開腹直視下將兔VX2腫瘤組織塊種植于肝葉內，建立兔VX2肝種植瘤模型，術后7 d行MR常規掃描(包括T1WI和T2WI序列)，腫瘤模型制備成功的標準為肝內腫瘤直徑≥0.7 cm。45只新西蘭兔中2只肝臟未見成瘤，5只在行MRI掃描前因麻醉意外死亡，2只在飼養過程中死亡，成功造模36只，造模成功率80%。選取瘤灶形狀規則、大小基本一致的30只兔肝種植瘤模型進行后續實驗，腫瘤平均直徑為(1.09±0.11) cm。

2.實驗分組及抗血管生成治療實驗

將篩選后的30只兔肝種植瘤模型，隨機分為實驗組(n=15)和對照組(n=15)。術后第8天開始，實驗組每日使用索拉非尼(BAYER公司)進行灌胃治療，劑量為30 mg/kg/d；對照組每日使用5%葡萄糖進行灌胃，劑量為30 mg/kg/d，共給藥14 d。分別在治療前、治療后第7天、治療后第14天(即術后第7、14、21天)行MRI常規掃描和DCE-MRI掃描。

3.檢查方法

MRI掃描采用Siemens 3.0 Tim skyra 磁共振掃描儀，膝關節線圈。常規MRI掃描前，使用戊巴比妥鈉對實驗兔進行麻醉，劑量為1.5 mg/kg，麻醉滿意后將實驗兔仰臥于膝關節線圈內，為減少腹部呼吸運動使用腹帶加壓包扎，分別行T1WI、脂肪抑制T2WI及DCE-MRI掃描，掃描范圍從膈頂至腎臟下極水平。T1WI掃描參數：TR 790 ms，TE 18 ms，層厚2.5 mm，層間距0.25 mm， 視野130 mm×130 mm，矩陣320×240。T2WI掃描參數：TR 4010 ms，TE 73 ms，層厚3 mm，層間距0.3 mm， 視野130 mm×130 mm。 DCE-MRI掃描對比劑為釓雙胺注射液(Gd-DTPA-BMA，歐乃影) ，將Gd-DTPA-BMA 稀釋在0.9%的生理鹽水中配制成濃度為0.05 mmol/mL的注射液 ，按照0.30 mmol/kg的劑量進行注射，采用高壓注射器經耳緣靜脈注入，注射流率1 mL/s。DCE-MRI進行矢狀面掃描，采用T1加權的容積式插入法屏氣檢查(volumetric interpolated breath-hold examination，VIBE)序列，時間分辨力約為2.1 s，掃描參數：TR 5.51 ms，TE 2.46 ms，層厚3.0 mm，層間距0.6 mm，視野274 mm×341 mm，翻轉角12°，矩陣320×194，平掃使用5°、10°、12°、15°翻轉角行T1WI掃描，對比劑注射后，使用12°翻轉角掃描獲得無中斷的67期動態圖像，掃描時間為144 s。

4.圖像處理

將MR灌注圖像調入GE Omni-Kinetics灌注軟件。首先，對圖像進行運動校準，以減少呼吸運動的影響，使用3D非剛性配準(free form deformation，FFD) 模式，將校準后的圖像調入軟件，并按以下步驟處理灌注數據：①AIF(動脈輸入函數)勾畫和擬合，在血管較清晰的情況下，勾畫腹主動脈及肝門靜脈的ROI，ROI的直徑以不超過相應血管直徑的2/3為宜。選擇肝臟雙輸入模型，點擊“curving”得到兩個輸入血管的時間-濃度曲線并進行擬合；②選擇雙室Tofts模型。選擇病灶的最大層面，點擊“Calculate”進行計算；③選擇病灶圖像最大層面的強化明顯區域為ROI，每個病灶勾畫3～4個ROI(ROI范圍為60～90像素)，勾畫ROI時應避開腫瘤可見的壞死區、強化的血管等，點擊“report”，得到ROI的血流動力學參數，包括轉運常數(volume translate constant，Ktrans)、速率常數(reverse reflux rate constant，Kep)、血管外細胞外容積分數(extravascular extracellular volume fraction，Ve)和血漿容積分數(volume fraction of the plasma，VP)。為了減少誤差，對每個病灶的ROI進行3次測定，計算平均值，作為最終結果并記錄。

肝種植瘤最大徑在T1WI增強掃描圖像上進行測量，每個瘤灶均測量3次，取平均值并記錄。

5.病理形態學觀察及免疫組化分析

所有實驗兔完成第3次(即治療后第14天)DCE-MRI掃描后，通過空氣栓塞處死。取腫瘤組織及瘤周正常組織進行蠟塊包埋、切片(切片層面與成像層面保持一致，均為矢狀位)，行HE染色及VEGF、CD34(MVD)免疫組化指標檢查，選擇病灶最大層面進行分析。

VEGF及CD34免疫組織參照weidner等[3]的判斷標準：腫瘤內的孤立內皮細胞或內皮細胞簇被染成棕黃色的，并且與鄰近微血管或其他結締組織分開的認為是一個微血管。高倍鏡(×200)觀察，選擇5個染色明顯的視野，并記錄每個視野下微血管數目，計算其平均數，得到微血管密度(microvessel density，MVD)值。

VEGF染色結果：陽性細胞定義為胞漿內含有棕黃色或棕褐色顆粒的腫瘤細胞。低倍鏡下(×100 )選擇棕褐色染色區域，高倍鏡下(×400 )選取4個染色明顯的視野，間質染色不計入其內，計算每個視野內陽性細胞的數目及占視野內所有細胞數目的百分比，計算平均值并記錄。

病理切片HE染色及免疫組化的結果由病理科醫生在雙盲情況下按統一標準進行觀察并記錄。

6.統計學分析

結果

實驗組與對照組治療前的基線數據差異無統計學意義(P>0.05)。治療后，實驗組與對照組之間DCE-MRI參數Ktrans、Kep值差異有統計學意義(F=20.882,P=0.001；F=5.031,P=0.049，圖1～4)，且Ktrans值在兩組間不同觀察時間點的變化趨勢不同,差異有統計學意義(F=50.062,P<0.01 ，圖5，表1)，Kep值在兩組間不同觀察時間點的變化趨勢差異無統計學意義(F=0.181，P=0.836，表2 )。實驗組與對照組的Ve、Vp值差異無統計學意義(F=0.327，P=0.272；F=0.236，P=0.638)，且Ve、Vp值在兩組間不同觀察時間點的變化趨勢差異亦無統計學意義(F=0.088，P=0.916；F=0.127，P=0.881)。

表1 兩組肝種植瘤治療前后不同時間點的Ktrans值測量結果

注：a不滿足協方差矩陣球對稱條件，進行H-F校正，校正系數為0.759；b實驗組與對照組間Ktrans值差異有統計學意義；cKtrans值在兩組間不同觀察時間點的變化趨勢是不同的，差異有統計學意義。

表2 兩組肝種植瘤治療前后不同時間點的Kep值測量結果

注：a滿足協方差矩陣球對稱條件；b實驗組與對照組間Kep值差異有統計學意義；cKep值在兩組間不同觀察時間點的變化趨勢差異無統計學意義。

實驗組治療7天后腫瘤直徑增大(0.23±0.06) cm，治療14天后腫瘤直徑增大(0.43±0.21) cm；對照組治療7天后腫瘤直徑增大(0.31±0.09) cm，治療14天后腫瘤直徑增大(1.48±0.56) cm。治療7天后，兩組間腫瘤直徑增大值差異無統計學意義(P>0.05)；治療14天后，兩組間腫瘤直徑增大值差異有統計學意義(P<0.05)。

索拉非尼組的CD34染色結果顯示肝種植瘤內散在的血管內皮細胞呈棕黃色，主要位于腫瘤的邊緣(圖6、7)，免疫組化分析顯示兩組間MVD、VEGF差異有統計學意義(P<0.05)。相關性分析顯示Ktrans與MVD、VEGF之間呈正相關(r值分別為0.792和0.651)。其他定量參數Kep、Ve、 Vp與MVD、VEGF均無顯著相關性(表3、4)。

圖1 實驗組兔行DCE-MRI掃描獲得VX2肝種植瘤的Ktrans偽彩圖。a) 治療前，腫瘤呈高血流灌注(紅色區域)，Ktrans均值為(0.33±0.11)/min； b) 索拉非尼治療7天后，腫瘤內出現部分低血流灌注區(藍色區域)，Ktrans均值為(0.23±0.06)/min； c) 索拉非尼治療14d后，腫瘤稍增大，內部呈低血流灌注(藍色區域)，Ktrans均值為(0.13±0.02)/min。 圖2 實驗組兔行DCE-MRI掃描獲得VX2肝種植瘤的Kep偽彩圖。a) 治療前，腫瘤呈高血流灌注(紅色區域)，Kep均值為(2.43±1.20)/min； b) 索拉非尼治療7天后，腫瘤內出現少量低血流灌注區(藍色區域)，Kep均值為(1.76±0.87)/min； c) 索拉非尼治療14d后，腫瘤稍增大，內部有部分低血流灌注區(藍色區域)，Kep均值為(1.09±0.68)/min。

參數r值P值Ktrans0．7920．002Kep-0．160．96Ve0．0310．924Vp-0．0390．904

表4 DCE-MRI參數與VEGF之間的相關性

討 論

根據實體瘤療效評價標準(如RECIST1.1標準)及改良的mRECIST標準[4,5]，其評價結果可分為完全緩解、部分緩解、進展及穩定，但單純的形態學評價標準可能不能及時、準確地反映腫瘤對藥物治療的敏感性，而血流量、轉移常數等功能學參數關注腫瘤內部的血流灌注信息，在腫瘤大小改變之前即可出現變化。DCE-MRI從微血管水平對組織器官的微循環功能狀態進行觀測、評價[6]，并且避免了CT灌注掃描過高的輻射劑量[7]，其應用的數學模型更貼近真實的微環境，可提供更多的微循環信息，為腫瘤分子靶向治療療效評估提供了新的途徑。本研究將RECIST1.1標準作為評估靶向治療的標準，索拉非尼治療7天后，實驗組腫瘤最大徑與對照組變化差異無統計學意義，治療14天后，兩組間腫瘤直徑增大值差異有統計學意義，證明了索拉非尼治療有效。實驗組與對照組之間Ktrans、Kep值差異有統計學意義，且Ktrans值在兩組間不同觀察時間點的變化趨勢是不同的，在索拉非尼治療7天后，兩組間Ktrans值的差異即有統計學意義，說明DCE-MRI定量參數能評價分子靶向藥物抗血管生成治療的早期療效。

圖3 對照組兔行DCE-MRI掃描獲得VX2肝種植瘤的Krans偽彩圖。a) 治療前，腫瘤以高血流灌注為主(紅或黃色區域)，Ktrans均值為(0.35±0.09)/min； b) 安慰劑治療7天后，腫瘤增大，Ktrans均值為(0.37±0.06)/min; c) 安慰劑治療14d后，腫瘤明顯增大， Ktrans均值為(0.41±0.08)/min。 圖4 對照組兔行DCE-MRI掃描獲得VX2肝種植瘤的Kep偽彩圖。a) 治療前，腫瘤呈高血流灌注(紅色區域)，Kep均值為(3.12±2.13)/min； b) 安慰劑治療7天后，腫瘤稍增大，Kep均值為(2.75±0.72)/min； c) 安慰劑治療14d后，腫瘤明顯增大，Kep均值為(1.47±0.69)/min。

龔威等[8]學者應用DCE-MRI評價恩度對兔VX2骨腫瘤抗血管生成的療效，14 d后治療組Ktrans值明顯下降， 且Ktrans值與VEGF表達、MVD值均呈正相關關系，與本研究結果一致。楊蕊夢等[9]應用血管阻斷劑M410治療兔VX2種植性肝癌，治療后4 h行DCE-MRI檢查，治療組Ktrans值即開始下降。丁爽等[10]使用安維汀治療結腸癌(裸鼠皮下移植瘤模型)，治療后24、48 h行DCE-MRI檢查，兩組間Kep值差異亦有統計學意義，且與免疫組織化學結果呈正相關，與本研究結果不一致。Wang等[11]研究認為，Ktrans值主要由血流灌注和毛細血管通透性決定。肝種植瘤經索拉非尼治療后，腫瘤MVD減低，血流量減少，同時毛細血管通透性下降，使兩組間Ktrans值的差別更明顯。Kep值不僅受血流灌注量、血管通透面積等因素的影響，血管外細胞外組織間隙內流體靜水壓等其他因素的影響亦不能忽略，故兩組間Kep值的變化不如Ktrans值明顯。在本研究中，選用雙室Tofts血流動力學模型進行分析[12]，治療前后實驗組及對照組間Ve、Vp值差異無統計學意義，筆者認為Ve、Vp評價索拉非尼抑制兔VX2肝種植瘤模型的價值尚不能肯定，有待于進一步研究。

在本研究中，我們使用雙輸入雙室Tofts模型，以往的報道中，受限于當時的分析軟件，常常只對肝動脈進行計算，忽視了門靜脈供血，本研究選擇兔肝動脈及門靜脈作為輸入血管，進行擬合計算，這更符合肝臟腫瘤雙重血供的特點，計算更加準確。雙室模型分別指兔VX2肝種植瘤微血管及血管外細胞外間隙，該模型將釓離子對比劑在動脈內的分布差異考慮在內，所獲得的定量參數不僅可以反映單室模型所關注的血流量，而且可反映對比劑從血管內滲透到血管外細胞外間隙的相關指標，如血管的通透性等。與正常兔肝組織相比，肝種植瘤的Ktrans、Kep值較高，這與腫瘤新生血管成熟度較差、局部血流速度更快、內皮細胞間隙增大、血管表面滲透性增高的病理基礎相匹配[13]。

圖5 實驗組和對照組肝種植瘤分別于治療前、治療后7天、治療后14天測量的Ktrans值變化趨勢圖。實驗組Ktrans值持續下降；對照組Ktrans值治療后持續升高。兩組治療前后Ktrans值的變化趨勢不同，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖6 免疫組化MVD結果(×200)。a) 實驗組微血管密度較低； b) 對照組微血管密度較高。 圖7 免疫組化VEGF結果(×400)。a) 實驗組VEGF呈低表達； b) 對照組VEGF呈高表達。

鏡下觀察CD34和VEGF免疫組織化學染色多聚集在肝種植瘤及周邊，經索拉非尼治療后，實驗組腫瘤組織血管生成受到抑制，VEGF及MVD數量減少，與對照組差異有統計學意義，說明索拉非尼可以有效抑制兔VX2肝癌新生血管的生成。Ktrans與MVD、VEGF值具有較好的相關性(r=0.792，r=0.651)。Wang等[14]對比了DCE-MRI參數與VEGF、MVD、P53蛋白等參數，證實DCE-MRI可以評估肝癌新生血管及其狀態。Wedam等[15]為了評估bevacizumab(VEGFR受體的單克隆抗體)治療乳腺浸潤性癌的療效，行DCE-MRI檢查并進行分析，結果顯示Ktrans、Kep值下降，并與VEGF受體表達呈正相關。

本研究存在以下局限性：①樣本量較小，可能導致部分研究結果差異無統計學意義；②定量參數測量數據量大，測量繁瑣；③DCE-MRI掃描技術仍存在局限性，首先是掃描協議的不同，不同MRI掃描儀使用的掃描序列不同，會影響獲得的定量參數的準確性；④不同實驗選擇的血流動力學模型也不相同，得到的結果可能存在差異。

[1] Abou-Alfa GK，Schwartz L，Ricci S，et al.Phase Ⅱ study of sorafenib in patients with advanced hepatocellular carcinoma[J].Clin Oncol，2006，24(26):4293-4300.

[2] 史紅媛，田迎，羅松，等.動態增強MRI擴散加權成像及光學成像聯合監測抗血管生成治療后腫瘤反應的動物實驗研究[J].中華放射學雜志，2012，46(3):269-274.

[3] Weidner N.Tumour vascularity and proliferation:clear evidence of close relationship[J].Pathol，1999，189(3):297-299.

[4] Zhao JJ，Yan T，Zhao H，et al.Evaluation of eight different clinical staging systems associated with overall survival of chinese patients with hepatocellular carcinoma[J].Chin Med J (Engl)，2015，128(3):316-321.

[5] Kim SH，Kamaya A，Willmann JK.CT perfusion of the liver:principles and applications in oncology[J].Radiology，2014，272(2):322-344.

[6] Thng CH，Koh TS，Collins D，et al.Perfusion imaging in liver MRI[J].Magn Reson Imaging Clin N Am，2014，22(3):417-432.

[7] Thukral A，Thomasson DM，Chow CK，et al.Inflammatory breast cancer:dynamic contast-enhanced MR in patients receiving bevacizumab——initial experience[J].Radiology，2007，244(3)：727-735.

[8] 龔威，查云飛，閆力永，等.DCE-MRI評估Endostar對兔VX2骨腫瘤模型抗血管生成的療效[J].放射學實踐，2015，30(4):313-318.

[9] 楊蕊夢，鄒永，羅良平，等.動態增強MRI定量監測血管阻斷劑治療兔VX2種植性肝癌的效果[J].中國醫學影像技術，2013，29(11) :1786-1790.

[10] 丁爽，許永華，賈文霄，等.DCE-MRI各定量參數評價抗腫瘤血管藥物早期療效的應用價值[J].臨床放射學雜志，2014，35(5):779-783.

[11] Wang HJ，Li JJ，Chen F，et al.Morphological,functional and metabolic imaging biomarkers: assessment of vascular-disrupting effect on rodent liver tumours[J].Eur Radiol，2010，20(8):2013-2026.

[12] Sourbron S，Sommer WH，Reiser MF，et al.Combined quantification of liver perfusion and function with dynamic gadoxetic acid-enhanced MR imaging[J].Radiology，2012，263(3):874-883.

[13] Jiang HJ，Lu HB，Zhang ZR，et al.Experimental study on angiogenesis in a rabbit VX2 early liver tumour by perfusion computed tomography[J].J Int Med Res，2010，38(3):929-939.

[14] Wang B，Gao ZQ，Yan X.Correlative study of angiogenesis and dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging features of hepatocellular carcinoma[J].Acta Radiol，2005，46(4):353-358.

[15] Wedam SB，Low JA，Yang SX，et al.Antiangiogenic and antitumor effects of bevacizumab in patients with in flammatory and locally advanced breast cancer[J].J Clin Oncol，2006，24(5):769-777.