IL-6/sIL-6R復(fù)合物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF及MMP-9表達(dá)的影響

藺娜 宋欣偉 張繆佳

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以多關(guān)節(jié)腫痛為主要表現(xiàn)的一種慢性、全身炎性的自身免疫性疾病，其病因機(jī)制不明，遺傳因素、環(huán)境因素、炎癥因素等均與RA發(fā)病有關(guān)。慢性滑膜炎癥、滑膜增生、血管翳形成是RA慢性炎癥階段最突出的病理特征。炎癥反應(yīng)和血管形成是兩個(gè)相互依賴的過(guò)程，這些因子相互調(diào)節(jié)，形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)RA的發(fā)生與發(fā)展[1]。盡管RA血管翳的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但是目前有大量文獻(xiàn)證實(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是與血管翳生成密切相關(guān)的細(xì)胞因子，主要通過(guò)作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞參與RA血管翳的生成[2-6]。但其與炎癥反應(yīng)階段相關(guān)細(xì)胞因子的關(guān)系尚不清楚。IL-6是一種多效性前炎癥細(xì)胞因子，在RA炎癥反應(yīng)階段起著重要作用，且IL-6水平與疾病活動(dòng)性及臨床表現(xiàn)密切相關(guān)。前期研究證實(shí)，IL-6需與IL-6受體結(jié)合后才可發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。IL-6有兩種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中研究最多的一種是IL-6需要與IL-6Rα直接結(jié)合，形成IL-6/IL-6α復(fù)合物后再與gp130結(jié)合形成高親和力的復(fù)合物，從而發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)[7]。另外一種途徑是一種可溶形式的IL-6R（sIL-6R）與IL-6結(jié)合形成循環(huán)復(fù)合物，IL-6/sIL-6R復(fù)合物與表達(dá)gp130細(xì)胞結(jié)合，增加了對(duì)IL-6起反應(yīng)的細(xì)胞種類[8]。研究證實(shí)，許多IL-6引起的炎癥均是由sIL-6R介導(dǎo)的，因此IL-6/sIL-6R復(fù)合物才是重要的促炎癥介質(zhì)。目前抗IL-6Rα的人源化藥物Tocilizumab（TCZ）已應(yīng)用于臨床，該藥可減輕RA患者的癥狀，降低疾病的活動(dòng)度，但也有一定不良反應(yīng)，限制了該藥在臨床中的應(yīng)用[9]。因此IL-6/sIL-6R復(fù)合物在RA發(fā)病機(jī)制中的研究顯得更為重要。筆者探討RA關(guān)節(jié)局部高表達(dá)的IL-6/sIL-6R復(fù)合物是否與VEGF及MMP-9表達(dá)相關(guān)，旨在為RA的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)，并探索新的藥物治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，F(xiàn)BS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，重組人IL-6、sIL-6R購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司，兔抗人MMP-9一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；兔抗人VEGF一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；羊抗人GAPDH單克隆抗體購(gòu)自中國(guó)中杉金橋公司；Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；real-time PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HUVECs置于含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS 和青/鏈霉素（青霉素 100U/ml，鏈霉素 100mg/ml）的DMEM培養(yǎng)基中，在溫度為37℃，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2孵箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs，接種于6孔板中，接種密度為 1×105/孔。饑餓 6h 后，用 0、10、20、40、80ng/ml不同濃度的IL-6聯(lián)合sIL-6R 100ng/ml刺激細(xì)胞，培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞mRNA水平及蛋白表達(dá)。

1.2.2 real-time PCR檢測(cè)MMP-9及VEGF的mRNA表達(dá) Trizol法提取總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體積為5 μl，其中包括Power SYBR Green PCR Master Mix（2×）2.5μl，超純水 1.25μl，上下游引物各0.125μl及稀釋的cDNA 1μl。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。擴(kuò)增條件為：95℃ 10min，40 個(gè)循環(huán)（95℃ 15s，60℃1min）。以β-actin作為內(nèi)參基因。引物由Invitrogen公司合成，序列如下：MMP-9：上游引物 5′-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3′，下游引物 5′-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3'；VEGF 引物序列為：上游引物 5′-GAGGAGCAGTTACGGTCTGTG-3′，下游引物 5′-TCCTTTCCTTAGCTGACACTTGT-3′；β-actin 引物序列為：上游引物 5′-ACTGGAACGGTGAAGGTGACC-3′，下游引物 5′-AGAGAAGTGGGGTGGCTTTT-3′。 所有擴(kuò)增均在ABI 7900 real-time PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后作溶解曲線。以目的基因的Ct值減去內(nèi)參的Ct值為Δ內(nèi)參，2-Δ內(nèi)參值來(lái)表示目的基因mRNA表達(dá)水平的高低。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)MMP-9和VEGF蛋白的表達(dá) 提取標(biāo)本總蛋白，以蛋白總含量20μg加樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉液封閉，4℃孵育一抗過(guò)夜，第2天TBST洗膜3次，15min/次，孵育二抗 2h，TBST 洗膜 3 次，15min/次，顯影曝光，測(cè)定各條帶吸光度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，不同濃度IL-6/sIL-6R復(fù)合物與空白組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度IL-6/sIL-6R復(fù)合物與空白組 MMP-9及VEGF mRNA表達(dá)的比較 結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6 40ng/ml+sIL-6R 100ng/ml組及 IL-6 80ng/ml+sIL-6R 100ng/ml組VEGF及MMP-9的表達(dá)較空白組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），IL-6 20ng/ml+sIL-6R 100ng/ml組及IL-6 10ng/ml+sIL-6R 100ng/ml組較空白組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。另外HUVECs VEGF及MMP-9的表達(dá)與IL-6的刺激呈劑量依賴性。詳見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度IL-6/sIL-6R復(fù)合物與空白組MMP-9及VEGF mRNA表達(dá)的比較（與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 不同濃度IL-6/sIL-6R復(fù)合物與空白組MMP-9及VEGF蛋白表達(dá)的比較 結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6 40ng/ml+sIL-6R 100ng/ml組及 IL-6 80ng/ml+sIL-6R 100ng/ml組VEGF及MMP-9蛋白的表達(dá)較空白組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），IL-6 20ng/ml+sIL-6R 100ng/ml組及IL-6 10ng/ml+sIL-6R 100ng/ml組與空白組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），且MMP-9表達(dá)與IL-6的刺激呈劑量依賴性。詳見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度IL-6/sIL-6R復(fù)合物與空白組MMP-9及VEGF蛋白表達(dá)的比較（與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

3 討論

RA的發(fā)病機(jī)制涉及復(fù)雜的細(xì)胞免疫及體液免疫反應(yīng)，包括免疫復(fù)合物形成、血管反應(yīng)、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞在滑膜的浸潤(rùn)等。這些浸潤(rùn)的細(xì)胞與滑膜細(xì)胞一起釋放包括IL-6在內(nèi)的多種促炎癥介質(zhì)，作用于滑膜內(nèi)的其他細(xì)胞，形成滑膜及關(guān)節(jié)周圍的持續(xù)炎癥[1]。RA的滑膜改變可分為炎癥期、血管翳形成期和纖維化三期。炎癥期以IL-6為代表的炎癥因子的作用結(jié)果[10]，血管翳形成期以VEGF及基質(zhì)金屬蛋白酶為主導(dǎo)[11-12]，本研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的IL-6/sIL-6R復(fù)合物可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞VEGF及MMP表達(dá)，激活血管新生，加重關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)損傷，最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形。

RA患者血清及關(guān)節(jié)液中IL-6及sIL-6R明顯升高，且IL-6及sIL-6R水平與慢性滑膜炎的局部關(guān)節(jié)癥狀及關(guān)節(jié)破壞程度顯著相關(guān)[13-14]。研究表明，許多IL-6引起的炎癥是由sIL-6R介導(dǎo)的，Hashizume等[15]研究發(fā)現(xiàn)，IL-6、sIL-6R或IL-1β可誘導(dǎo)核因子κB活化因子受體（RANKL）表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活化，最終導(dǎo)致RA關(guān)節(jié)骨破壞，另外TNF-α和IL-17亦只有在sIL-6R存在時(shí)才能誘導(dǎo)RANKL的表達(dá)。Misato Hashizume等[16]研究證實(shí)IL-6/sIL-6R復(fù)合物而非IL-6可促進(jìn)HUVECs的血管增生。而筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)IL-6并不能刺激HUVECs表達(dá)VEGF及MMP-9。也有研究證實(shí)IL-6聯(lián)合sIL-6R作用于滑膜內(nèi)其他細(xì)胞，可引起滑膜及其他關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的持續(xù)炎癥，加重關(guān)節(jié)局部的骨破壞。

VEGF是一類特異性血管生成因子，可以促進(jìn)內(nèi)皮，細(xì)胞的增殖和提高血管通透性，促進(jìn)新生血管的形成，參與RA關(guān)節(jié)周圍的血管翳生成，為滑膜細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)及氧，并招募炎癥因子[17]。MMP-9是一類能有效降解細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞膜成分的蛋白水解酶，同時(shí)也能釋放生長(zhǎng)因子、趨化因子和細(xì)胞因子等，其作用底物廣泛，表達(dá)細(xì)胞眾多，參與人體許多生理和病理過(guò)程[18]。Jackson等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在MMP-9的作用下可導(dǎo)致慢性滑膜組織增生，表現(xiàn)為滑膜襯里細(xì)胞增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜下細(xì)胞增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及滑膜下層血管生成，增生的滑膜組織向軟骨面生長(zhǎng)，形成血管翳。

本研究證實(shí)IL-6/sIL-6R復(fù)合物而非IL-6可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血管生成相關(guān)因子VEGF及MMP-9。可見(jiàn)IL-6和VEGF在RA發(fā)生、發(fā)展是級(jí)聯(lián)先后出現(xiàn)的，IL-6/sIL-6R復(fù)合物可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF和MMP-9，使內(nèi)皮遷移和增殖，改變小血管通透性，導(dǎo)致血管翳形成，加重骨破壞。因此，IL-6/sIL-6R復(fù)合物在RA的炎癥期及血管翳形成期起著承上啟下的作用，在RA的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。

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