ADAMTS-1基因多態(tài)性與漢族人群原發(fā)性高血壓相關性研究

呂晨鈴 陳超 鄭周 劉鵬 何欣威 金笑平

原發(fā)性高血壓是一種多基因遺傳病，是冠心病、腦梗死等心腦血管疾病的獨立危險因素[1]。我國高血壓的控制現狀目前仍不夠理想，2012年15歲以上高血壓患者達2.66億[2]；2014年中國心血管病報告統計全國高血壓患者達2.7億，呈不斷增加的趨勢[3]。原發(fā)性高血壓患者常有炎癥因子水平升高、血管內皮功能異常，具體機制還未完全明了[4-6]。含血小板反應素的去解聯金屬蛋白酶1（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type motifs 1，ADAMTS-1）是一種新發(fā)現的鋅離子（Zn2+）依賴性金屬蛋白酶，可以調節(jié)炎癥反應，改變血管內皮功能[7-8]，可能參與了原發(fā)性高血壓的病變過程。ADAMTS-1基因-99/+447片段rs402007位點位于第1外顯子區(qū)，轉錄后為5′-UTR區(qū)，既往研究發(fā)現，rs402007位點基因多態(tài)性與急性腦梗死、冠心病及他汀類藥物療效相關[9-10]，提示該SNP位點基因突變可能參與翻譯調節(jié)，影響mRNA的穩(wěn)定性、翻譯效率等。由此，筆者通過檢測原發(fā)性高血壓患者ADAMTS-1啟動子區(qū)rs402007位點基因多態(tài)性，探討兩者的關系，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2013年6月至2016年6月于臺州醫(yī)院就診無血緣關系的原發(fā)性高血壓患者469例（EH組），男 250 例，女 219 例，年齡 48～76（67.591±9.173）歲。高血壓診斷標準參照《中國高血壓防治指南2010》：收縮壓≥140mmHg和（或）舒張壓≥90mmHg、既往曾經診斷為高血壓者、最近2周內服降壓藥血壓正常者均作為高血壓患者。選擇同期在臺州醫(yī)院體檢的年齡、性別與EH組匹配且無高血壓病史的健康體檢者229例（NT組），男 129 例，女 100 例，年齡 42～73（66.201±9.860）歲。所有研究對象之間無血緣關系。排除標準：急慢性腎小球腎炎；腎動脈狹窄；原發(fā)性醛固酮增多癥；嗜鉻細胞瘤；庫欣綜合征；肢端肥大癥；主動脈縮窄；睡眠呼吸暫停綜合征；長期服用激素類、中樞神經類、非類固醇類抗炎藥物者。兩組間性別、年齡的比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究經臺州醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采集所有受試者空腹肘靜脈血2ml，放置于加有抗凝劑的試管，再分裝至1.5ml的清潔EP管。選用人血液基因組DNA抽提試劑盒（上海捷瑞生物工程公司）進行DNA抽提。采用核酸定量分析儀測定A260/A280比值，將比值介于1.7～2.0的DNA標本進行編號，作為PCR擴增模板，并放置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因擴增和測序 上游引物為5′-GGCGTCTTTGGGATGGAA-3′；下游引物：5′-CAGGAGACACCGCTCGTAG-3′（引物由上海捷瑞生物工程公司合成）。反應體系：10×緩沖液 2.5μl，DNA 模板 1.0μl，離子（Mg2+）1.0μl（25mmol/L），Mix dNTP 0.5μ（l10mmol/L），Taq DNA聚合酶0.25μ（l5U/μl），上下游引物各0.5μl，用雙蒸餾水將PCR反應體系的總體積加至25μl。反應條件：95℃預變性 2min，94℃變性 45s，56℃退火 45s，72℃延伸 1min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。取5μl PCR擴增產物于1.8%瓊脂糖凝膠電泳，經溴化乙錠染色，凝膠成像分析儀分析PCR產物特性。對瓊脂凝膠中的目的DNA片段進行切膠回收純化，純化后的DNA由上海生工生物工程公司于ABI-PRISM3730全自動測序儀上進行DNA序列測定。

1.3 統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件。計量資料用表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗；檢測基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；基因型及等位基因頻率的計算采用基因計數法，等位基因頻率=（2×純合子數+雜合子數）（/2×受檢人數）；采用二元logistic回歸分析危險因素；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組間一般資料的比較 兩組間吸煙史、飲酒史、HDL-C、糖尿病病史的差異均無統計學意義（均P＞0.05）；兩組間收縮壓、舒張壓、BMI、LDL-C、TG、TC 的差異均有統計學意義（均P＜0.05），詳見表1。

表1 兩組間一般資料的比較

2.2 兩組間基因型及等位基因比較 rs402007（G/C）位點基因型檢測部分結果見圖1。rs402007（G/C）位點的GG、GC、CC 的基因頻率分別為 0.287、0.523、0.191，G 和C的位點基因頻率為0.548、0.452；兩組間基因型分布經 χ2檢驗符合 Hardy-Weinberg平衡（χ2=1.620、2.511，P=0.203、0.113），表明研究對象具有群體代表性。EH組GC+CC基因型頻率為0.742，NT組GC+CC基因型頻率為 0.655，差異有統計學意義（χ2=5.695，P=0.020，OR=1.515）；兩組間C等位基因頻率分別為0.474、0.406，差異有統計學意義（χ2=5.796，P=0.016，OR=1.320），詳見表2。

表2 兩組間ADAMTS1基因rs402007位點基因型和等位基因頻率的比較

2.3 原發(fā)性高血壓相關危險因素logistic回歸分析 將性別（男=1，女=2）、年齡（＜55 歲=0，≥55 歲=1）、BMI值（＜25=0，≥25=1）、LDL（＜2.58mmol/L=0，≥2.58mmol/L=1）、HDL （＜1.04mmol/L=0，≥1.04mmol/L=1）、TG（＜1.7mmol/L=0，≥1.7mmol/L=1）、TC（＜5.2mmol/L=0，≥5.2mmol/L=1）、吸煙史（無=0，有=1）、飲酒史（無=0，有=1）、糖尿病史（無=0，有=1），基因型（GG=0，GC+CC=1）等危險因素進行賦值并校正相關危險因素后，兩組間基因型差異有統計學意義（OR=1.809，P=0.028），詳見表3。

圖 1 ADAMTS-1基因 rs402007位點測序圖（a：GG；b：GC；c：CC）

表3 原發(fā)性高血壓相關危險因素回歸分析

3 討論

原發(fā)性高血壓占所有高血壓患者的90%～95%，炎癥反應及內皮損傷在原發(fā)性高血壓的病變過程中起重要作用。ADAMTS-1作為一種炎癥相關蛋白，與原發(fā)性高血壓的發(fā)生、發(fā)展有一定的聯系。Lemarchant等[7]研究發(fā)現，ADAMTS-1 可以通過調節(jié) IL-1β、TGF-β1、TNF-α等炎癥因子參與炎癥反應，促進內皮細胞損傷。研究報道，ADAMTS-1可以通過結合FGF-2，并上調FGF-2，調節(jié)成纖維細胞的生長，促進膠原纖維的形成及成熟[11]；ADAMTS-1可以通過其C末端與VEGF結合，降低VEGF的表達，抑制血管再生修復功能，進而損害血管內皮細胞[12]；多能蛋白聚糖通過調節(jié)血管平滑肌細胞的增殖，參與血管生成，對血管壁的結構及功能有著重要作用，而ADAMTS-1能降解多能蛋白聚糖，進而損傷血管[13]。Jan-Erik等[14]研究亦證實，ADAMTS-1的表達修飾能導致血管形態(tài)學的明顯改變。因此筆者推測，ADAMTS-1通過調節(jié)炎癥反應，促進血管彈性纖維加速溶解，降低彈性纖維含量，促進膠原纖維的合成，血管壁增厚，改變血管壁的結構及功能，引起血管順應性下降，從而造成平滑肌內鈣離子聚集，血管收縮，使得外周血管阻力增加，該機制可能是原發(fā)性高血壓發(fā)病原因之一。

原發(fā)性高血壓是一種遺傳和環(huán)境因素相互作用所致的多基因遺傳病。隨著人類基因組計劃的完成，在基因層面刪選原發(fā)性高血壓易感基因，從遺傳學角度探討單個核苷酸變異（SNP）在原發(fā)性高血壓發(fā)生、發(fā)展中的作用已備受關注。Pavlyushchik等[15]的研究結果表明，血管緊張素（ACE）基因的D等位基因可增加人體鈹、鉬、釷含量，并降低鋅、硒、鉈的水平，從而參與原發(fā)性高血壓的發(fā)生、發(fā)展；Xie等[16]在一項Meta分析中提出內皮一氧化氮合酶基因（eNOS）+894 SNP T等位基因和-786 SNP C等位基因是原發(fā)性高血壓的易感等位基因；坦佩雷成人心血管風險的研究（TAMRISK）表明鐵調素調節(jié)蛋白（HJV）基因rs16827043位點的G等位基因是原發(fā)性高血壓的易感等位基因等[17]。全人類基因組關聯研究證實ADAMTS-16為遺傳性高血壓病的易感基因[18]；Gopalakrishnan等[19]通過大鼠模型研究，進一步證實了ADAMTS-16基因在遺傳性高血壓中的作用。而ADAMTS-1與ADAMTS-16同屬ADAMTS家族，相似的結構特征賦予兩者類似的生物學特性。我們前期研究發(fā)現，ADAMTS-1啟動子區(qū)rs402007位點基因多態(tài)性與急性大動脈粥樣硬化性腦梗死相關[9]。因此推測，ADAMTS-1啟動子區(qū)周圍基因突變或基因多態(tài)性能影響其蛋白表達，從而參與原發(fā)性高血壓的病變過程。因此，我們進行了該臨床研究，結果提示漢族人群原發(fā)性高血壓與ADAMTS-1基因啟動子區(qū)rs402007（G/C）位點多態(tài)性相關，目前國內外尚未有同類報道。

本研究結果表明，原發(fā)性高血壓組rs402007位點GC+CC基因型頻率及C等位基因頻率均較NT組高，logistic回歸分析提示其為原發(fā)性高血壓的獨立危險因素。C等位基因攜帶者患原發(fā)性高血壓的風險是NT的1.320倍，提示C等位基因可能是原發(fā)性高血壓的一個易感等位基因。本研究結果顯示rs402007位點G和C等位基因頻率分別為0.548、0.452，與NCBI報道的中國人群基因型頻率基本一致。因此筆者推測ADAMTS-1基因rs402007位點G→C突變可能通過影響ADAMTS-1蛋白的表達，從而提高原發(fā)性高血壓的患病風險。

綜上所述，ADAMTS-1基因 rs402007位點基因多態(tài)性可能與原發(fā)性高血壓的易感性有關，C等位基因可能是易感等位基因。

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