免疫球蛋白G 提純方法的研究進展

李登亮， 伊淑帥， 郭衍冰，2， 劉宏凱， 牛江婷， 董國英， 胡桂學

(1. 吉林農業大學動物科學技術學院， 吉林 長春 130118 ；2. 吉林省畜牧獸醫科學研究院， 吉林 長春 130022；3. 北京師范大學全球變化與地球系統科學研究院， 北京 海淀 100875)

免疫球蛋白(IgG)是血液中除白蛋白外最豐富的蛋白，由通過二硫鍵連接的兩條輕鏈和兩條重鏈組成，呈“Y”型。 免疫球蛋白(IgG)約占血液總免疫球蛋白的75%，并且是與體液免疫應答相關的主要免疫球蛋白[1]，作為參與機體對抗感染的主要分子，具有與病原體或毒素結合，激活補體，加強吞噬作用的殺傷作用，啟動過敏反應和減輕移植器官排斥的能力，是臨床應用中使用最廣泛的免疫球蛋白[2-3]。 IgG 與其他免疫球蛋白相比，具有持續時間長、含量高、穩定性強等優點，一般情況下，通過對動物機體或動物性產品內特異性IgG 含量的測定，可判斷該動物是否曾患有相關疾病或其產品是否合格，這在動物的出入境檢驗檢疫及其產品的質量評價中應用十分廣泛，因此IgG 的分離純化倍受關注。本文對不同的血清IgG 提純工藝進行了詳細的闡述與比較，以期為IgG 生產工藝的改良提供理論參考。

1 免疫球蛋白的粗提

1.1 有機溶劑沉淀法 目前，有機溶劑沉淀法是一種被廣泛應用于蛋白質制劑生產的提純方法，其中，低溫乙醇沉淀法是生產中應用最為廣泛的一種方法，也是WHO 規程和中國生物制品規程推薦用的方法。該方法是1949 年由美國科學家Cohn 等首次提出，用于制備血清IgG，其作用原理是利用有機溶劑改變溶液的介電常數，從而通過控制蛋白質之間靜電相互作用的辦法選擇性地沉淀蛋白。 低溫乙醇沉淀法可同時分離多種血漿成分，具有良好的分辨率和純化效果，而且對細菌和病毒有消除滅活的作用。 但該方法存在的不足也不容忽視，如40% ～50%的IgG 可能在非IgG 上清液中丟失或與雜質共沉淀。 此外，沉淀階段需要在低于0 ℃的溫度下進行，以避免蛋白質的變性[4]。 高濃度的乙醇也會影響IgG 的穩定[5]。

1.2 鹽析法 鹽析法的原理是根據不同蛋白質在同一濃度的鹽溶液中溶解度不同及同一蛋白質在不同濃度的鹽溶液中溶解度也不同，從而通過改變鹽溶液濃度達到目的蛋白(如IgG)與其他雜質蛋白分離純化的目的。 常用的鹽析法有飽和硫酸銨分步沉淀法、多聚磷酸鈉絮凝法、FeCl3沉淀法等。

1.2.1 飽和硫酸銨分步沉淀法 飽和硫酸銨分步沉淀法在人以及哺乳動物血清蛋白的分離純化中得到了廣泛的應用。 由于水中的硫酸銨溶解度大且受溫度影響小，一般不會引起蛋白質的變性；此外，高濃度硫酸銨對微生物和蛋白酶具有抑制作用，從而保護蛋白質生物活性。 Mariam S H S 等通過飽和硫酸銨沉淀法成功地純化針對乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的IgG，回收率和純度分別為99%和94%[8]。 IgG 的提取過程中，如果結合蛋白質的等電點(pI)沉淀就更有利于除去雜蛋白。 如在提純豬血清IgG 時，37%硫酸銨飽和度下，pH 值4.5時IgG 回收率為70%，而pH 值7.4 時IgG 回收率達到80.5%[6]。 該方法操作簡單，產品含量和得率都較高，利于工業化大量生產。 缺點是沉淀的抗體必須再溶解并存在蛋白質聚集體，且鹽析過程所花費的時間較長[9]。

1.2.2 多聚磷酸鹽或FeCl3沉淀法 相對于硫酸銨沉淀法，多聚磷酸鹽沉淀法或FeCl3沉淀法提純IgG 更安全可靠，尤其是當IgG 作為醫藥行業和保健食品行業的重要添加劑。 多聚磷酸鹽作為食品添加劑可以在肉制品中使用以提高產品的保水性，或者作為絮凝劑用于食品加工。 而FeCl3沉淀法從原料中提取的IgG 溶液中只含有Fe3+離子，只調節pH 值至弱堿性，Fe3+離子就會和水中的OH-離子結合成Fe(OH)3沉淀，方便快捷的達到了除鹽的效果，即使殘存少量的Fe3+離子也對人體有益處。 羅磊采用多聚磷酸鹽沉淀法及FeCl3沉淀法成功從豬血清中提純IgG，并表明FeCl3分離豬血清IgG 操作簡便，分離效果好，安全可靠，實用性高，可以用于食品用IgG 的工業化生產[6]。 龐晨通過這兩種方法成功從牦牛血清中分離純化IgG，得率分別為6.48 mg/mL 和8.28 mg/mL[7]。

1.3 正辛酸-硫酸銨法 正辛酸-硫酸銨法是將有機溶劑辛酸與無機鹽硫酸銨相結合的一種提純免疫球蛋白的方法。 其提純IgG 的原理是pH 值為4.2 ～4.8 條件下辛酸可沉淀血清中的非免疫球蛋白類蛋白，含免疫球蛋白的上清液再用飽和硫酸銨沉淀法，從而對血清中的IgG 進行分離純化。 有試驗表明，一定濃度的辛酸主要使血清中的白蛋白沉淀，而不會影響免疫球蛋白的分級純化[10，11]，并且在免疫球蛋白沉淀過程中，辛酸還可避免免疫球蛋白的降解或聚集[12，13]。 該方法允許球蛋白濃度≥15 ng/mL，比較適合于大量、高效價血清IgG 提純，且簡單易行，無需復雜的設備儀器。 缺點是IgG 需要溶解，在商業規模生產中，操作步驟增加會使分餾過程易受微生物污染。

2 免疫球蛋白的進一步純化

免疫球蛋白經粗分級后，為了得到更高純度的IgG，通常要進行細分級，這一過程常采用柱層析的方法。 常見的有凝膠過濾層析法、離子交換層析法、親和層析法等，細分級后IgG 的純度一般可達到90%以上。

2.1 凝膠過濾層析 凝膠過濾層析法是一種呈溫和的物理性純化方法，一般不影響蛋白質分子的生物活性，該法是基于樣品中蛋白質分子的相對大小和立體結構差異，在通過多孔凝膠介質時達到分離純化目的[15]。 對于Ig 類抗體，凝膠過濾層析可去除與目的抗體具有相同電荷性的雜質[14]。 當然，相對于親和層析法分離純化目的蛋白，凝膠過濾層析的特異性相對較差，且因靶蛋白在柱中不能被保留而呈現相對較低的分辨率，但該方法仍是與其他類型純化組合使用的有價值的方法。

2.2 離子交換層析 離子交換層析是根據蛋白質分子所帶電荷及電荷密度不同，通過不同蛋白質吸附到吸附劑上的能力差異來實現分離純化免疫球蛋白。 蛋白質是由氨基酸構成的兩性電解質，其所帶電荷由溶液pH 值所決定，且在低離子強度時可被同性的離子競爭置換而解脫，通過增強洗脫液的離子強度或改變pH 值來改變蛋白質的結合能力，使不同電荷的蛋白質得以分離。 Wongchuphan 等成功從兔血清中提純IgG，產率為80%，純度達到83%[16]。 該法提純IgG 也存在一些不足，如用時長，裝柱要求高，期間也會由于各種因素影響而使蛋白質變性，易變性失活的抗體不宜采用此方法。

2.3 親和層析 親和層析是一種特異性吸附層析技術，其原理是以目標分子與親和配體特異性、可逆性結合為基礎，通過生物高分子所特有的生物活性而進行的蛋白質分離、提純和濃縮。 親和層析具有高效、快速、純化結果好等優點，并逐漸成為大分子生物提純技術之一。 但存在偶聯配體純度要求高；目的蛋白活性可能被洗脫液損害，成本高，費用大等弊端。 因此，許多研究者試圖構建純化配體作為蛋白A 的替代[17-18]。 Tomoya Sugita 等[19]使用肽陣列篩選結合IgG 的Fc 區的肽配體，獲得可識別結合人和小鼠IgG 的高親和力八聚體肽NKFRGKYK和NARKFYKG，抗體獲得的產量分別為69% 和80%，從而表明篩選的肽可用作IgG 的親和純化配體。 可見，親和層析過程親和配體的選擇逐漸成為IgG 純化的熱點問題。

3 展望

免疫球蛋白具有很多重要的生理功能，尤其是IgG，其不僅在血液免疫球蛋白中含量豐富，而且在臨床診療、生物制藥、疫苗生產、疾病預防及食品添加等領域已經廣泛被應用。 隨著近年來免疫學和遺傳工程的發展，對具有高純度，強生物活性和低成本的抗體的需求變得越來越迫切。 因此，IgG 的制備已經成為當前研究熱點之一，許多新型方法應運而生。 雙水相系統就是利用蛋白質分子可以被特定相穩定萃取，從而增加目標蛋白質(IgG)濃度，達到更有效地萃取效果[20]。 天然IgG 結合蛋白如蛋白A 和來自細菌來源的蛋白G 已被普遍用作配體。 然而由于該配體的生產成本高，穩定性差，存在宿主細胞成分的污染，以及需要開發柱結合抗體的溫和洗脫條件等，所以為了補充天然蛋白質配體，一些由天然或非天然氨基酸組成的肽合成配體得到了廣泛的探索并已經被成功開發[21-22]。 然而當前應用于工業生產的抗體分離純化工藝比較傳統，這就需要尋求一種將傳統生產與新型工藝相結合的得率高、對抗體活性無影響、節約成本、可加工集成的方法來代替傳統工藝。 隨著IgG 提取純化技術的更新發展，免疫球蛋白提純必將實現工業化量產，其應用范圍也會進一步擴大，因此對IgG 的開發應用前景相當樂觀。