3 對中藥對大腸桿菌O2 的聯合抑制作用研究

王艷萍， 徐倩倩， 郭時金， 張 穎， 董 林， 楊麗梅， 馬 力， 沈志強

(1.山東省濱州畜牧獸醫研究院， 山東 濱州 256600 ；2.山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開發推廣中心，山東 濱州 256600 ；3.山東綠都安特動物藥業有限公司， 山東 濱州 256600)

大腸桿菌感染可引起畜禽流行性大腸桿菌病，嚴重制約了養殖業的健康發展，與此同時，隨著養殖規模的不斷發展壯大，以及新舊動能轉換趨勢的發展，中獸藥代替抗生素的趨勢越來越迫切了。

中華醫藥博大精深，它是以整體觀念和辯證論治為核心的獨特醫學科學體系，是中華民族優秀文化寶庫中的一支奇葩。 中獸藥是中獸醫學防治畜禽疾病的重要手段，中獸藥的配伍與禁忌是提高其臨床療效，保證用藥安全的重要環節。 中獸醫藥因具備多種有效成分、無殘留、多作用靶位、作用范圍廣、不易產生耐藥性等優點而成為新型抗菌藥物及抗菌藥物增效劑的篩選靶點之一[1]。

為尋找抗雞大腸桿菌的中獸藥，本試驗以黃連-紫花地丁、黃連-蘆丁、黃連-雙花連翹3 對中藥對大腸桿菌的抑制為研究對象，通過微量棋盤法篩選最佳配比，以期達到合理用藥、節約用藥的目的，為中獸藥發展做出奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 藥材 黃連、紫花地丁、蘆薈，均購自安國伊康藥業有限公司；雙花連翹提取物，購自四川恒瑞通達生物科技有限公司；0.5 麥氏比濁管、MHB、MHA培養基等，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 菌株 大腸桿菌O2標準菌株由安徽農業大學基礎獸醫學教研室饋贈。

1.3 儀器 ST16R 離心機，美國ThermoFisher ST 16R；RE-52AAA 旋轉蒸發器，上海嘉鵬科技有限公司；SH-B 95A 型循環水式多用真空泵，上海豫康科教儀器設備有限公司；臺式小型離心機，Sigma 公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 藥物的提取及濃縮 稱取30 g 黃連，粉碎，后加入10 倍、8 倍、8 倍水，煎煮提取3 次，每次2 h，3 000r/min 離心10 min，-0.1 Mpa 濃縮；稱取20 g 紫花地丁，加入0.8 L 水冷凝回流煮沸1 h，再加入0.4 L 水冷凝回流煮沸1 h，3 000 r/min 離心10 min，-0.1 Mpa濃縮至1 g/mL；稱取20 g 蘆薈，加入40 mL水加熱使溶解，3 000 r/min 離心10 min，-0.1 Mpa濃縮至0.5 g/mL。

1.4.2 制備大腸桿菌菌液 將大腸桿菌O2菌株，挑取平板上的單菌落，接種至肉湯培養基中，置37 ℃培養箱中，過夜培養，稀釋至每毫升含細菌1.5 ×105CFU。

1.4.3 黃連、紫花地丁、蘆薈和雙花連翹最低抑菌濃度的檢測 以微量稀釋法(microdilution)進行：取U 形底96 孔板，在第1 -9 孔中每孔加入MH 肉湯50 μL，第1 孔加入藥物原液50 μL，混合均勻后，依次倍比稀釋至第9 孔，自第9 孔中吸取50 μL棄去。第10 孔加入MH 肉湯100 μL 作為空白對照，第11孔加入藥物原液100 μL 作為藥物對照，第12 孔為菌液對照(加入MH 肉湯50 μL)；在第1 孔至9 孔和12 孔各加入以上制備好的菌液50 μL；加完液后蓋上蓋，振蕩混勻，置入墊有濕潤紗布的方形盤內，于36 ℃培養18 h ～24 h 后，觀察結果。1.4.4 黃連-紫花地丁、黃連-蘆薈、黃連-雙花連翹聯合抑菌效果的測定 微量棋盤稀釋法，基本方法同微量稀釋法。 用滅菌后的96 孔微孔板，在第1 ～6 行沿X 軸方向(從左到右)每孔中依次加入：MHB，1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC、8 MIC 的黃連藥液各25 μL，以同樣的方法在第A-F 列沿Y 軸方向(從上到下) 每孔中依次加入8 MIC、4 MIC、2 MIC、1 MIC、1/2 MIC 的紫花地丁(蘆薈或雙花連翹提取物)提取物液、MHB 各25 μL，將兩藥混合均勻。 然后加入制備好的菌液50 μL，使最終抗菌藥物濃度與計劃稀釋度相同，加液完畢，蓋上蓋，振蕩混勻，放入墊有濕紗布的方盤內，36 ℃培養18 h ～24 h，觀察結果。 棋盤稀釋法藥物加入方法按表2，并設立平行樣。 兩種藥物組合后每孔的最終濃度則為原藥物濃度的1/4。 加液完畢后放入36.5 ℃培養箱，培養18 h。

表1 微量稀釋法藥物加入方法

表2 棋盤稀釋法藥物加入法

1.4.5 結果判定標準 用消毒棉簽將U 型底96孔聚乙烯微孔板的每孔培養物轉移至MHA 平板，置于36.5 ℃培養箱，培養過夜，觀察細菌生長情況。

2 結果

2.1 黃連、紫花地丁、蘆薈、雙花連翹提取結果 黃連、紫花地丁、蘆薈、雙花連翹的終濃度分別為1.0 g/mL、1.0 g/mL、0.5 g/mL 和10 g/mL。

2.2 最低抑菌濃度(MIC)

2.2.1 單獨用藥時黃連MIC 為(1/8 原液濃度)，紫花地丁MIC 為1/4 原液濃度，蘆薈MIC 為原液濃度，雙花連翹MIC 為1/4 原液濃度。

2.2.2 聯合抑菌效果 黃連與紫花地丁聯用時，黃連的MIC(聯) =1/16 原液，紫花地丁聯用時的MIC(聯) =1/64 原液；黃連與蘆薈聯用時，黃連的MIC為1/128 原液，蘆薈的MIC(聯) =1/8 原液；黃連與雙花連翹聯用時，黃連的MIC 為1/64 原液，雙花連翹(聯)聯用時的MIC(聯)為1/16 原液。

2.2.3 聯合抑菌FIC FIC(黃連-紫花地丁) =黃連聯用時的MIC/黃連單測時的MIC+紫花地丁聯用時的MIC/紫花地丁單用時的MIC =(1/16 原液)/(1/8 原液) +(1/64 原液)/(1/4 原液) =1/2+1/8 =0.625，0.5 ＜0.625 ＜1，二者表現為相加作用。

FIC(黃連- 蘆薈) = 黃連聯用時的MIC/黃連單測時的MIC+蘆薈聯用時的MIC/蘆薈單用時的MIC= (1/128 原液)/(1/8 原液) + (1/8 原液)/(1/4 原液) =1/16 +1/2 =0.5625，0.5 ＜0.5625 ＜1，二者表現為相加作用。

FIC 黃連-雙花連翹=黃連聯用時的MIC/黃連單測時的MIC +雙花連翹聯用時的MIC/雙花連翹單用時的MIC =(1/64 原液)/(1/8 原液) +(1/16 原液)/(1/4 原液) =1/8 +1/4 =0.375，0.375 ＜0.5，二者表現為協同作用。

3 結論

黃連與紫花地丁聯用時表現為相加作用；黃連與蘆薈聯用時表現為相加作用；黃連與雙花連翹提取物聯用時表現為協同作用。

4 結果分析與討論

由于中藥成分復雜，不同中藥提取物抗菌活性不同，作用機理不同于抗生素，療效往往受中藥各成分間的協同和綜合作用影響[2-4]。

關于黃連與紫花地丁、黃連與蘆薈、黃連與雙花連翹這3 對中藥對聯合抑菌試驗均未見相關報道。 由以上試驗結果可知，黃連單獨應用時，最低抑菌濃度為1/8 原液，紫花地丁單獨用藥時，抑菌濃度為1/4 原液，當二者聯合應用時，黃連抑菌濃度降為單用時的1/2，紫花地丁抑菌濃度降為單用時的1/12，FIC=0.625，表現為相加作用；蘆薈單用時的MIC 為原液，與黃連聯用時，最低抑菌濃度為1/8 原液，降為原來的1/8，并且使黃連最低抑菌濃度降為原來的1/16，FIC =0.562 5，表現為相加作用；雙花連翹單獨應用時，最低抑菌濃度為1/4 原液，與黃連聯合應用時，最低抑菌濃度降為原來的1/4，使黃連的抑菌濃度降為原來的1/8，FIC =0.375，表現為協同作用。

說明黃連與紫花地丁聯合應用后，抑菌效果明顯增強，目前尚未見到黃連和雙花連翹提取物聯合抑菌方面的報道，為黃連和紫花地丁的進一步研究奠定了基礎。