細小病毒宿主進化的研究進展

孫明潔， 董國英， 董 潔， 張雪竹， 曾 倩， 王 開， 胡桂學

(1.吉林農業大學動物科學技術學院， 吉林 長春 130118 ；2.北京師范大學全球變化與地球系統科學研究院，北京 海淀 100875 ；3.吉林農業大學生命科學學院， 吉林 長春 130118)

細小病毒作為一種宿主廣泛的病毒，流行已將近一個世紀。 而今，已成為侵染動物最頻繁的病毒之一。 第一例貓細小病毒(Feline parvovirus virus，FPV)是在20 世紀初期由法國學者Verge 發現，隨后由Bilin 和Johnson 于1957 年成功分離培養出該病毒[1]。 . FPV 屬于細小病毒科、細小病毒屬成員，該屬病毒是自然分布極廣的一種微小的單股負鏈DNA 病毒粒子。 自FPV 被發現以來，相繼衍生出犬細小病毒(Canine parvovirus， CPV)、水貂腸炎病毒(Mink enteritis virus， MEV)和浣熊細小病毒(Raccon parvovirus， RaPV)等[2]。 近幾年研究發現該屬病毒成員不斷增多，如博卡病毒(Bocavirus)等，嚴重危害了人獸健康。 由于細小病毒的迅速傳播和基因突變等變化，導致病毒產生較強的致病力和抗原漂移現象[3]。 同時細小病毒宿主范圍仍在不斷地擴大更新，現在已成為貓科、犬科、經濟動物和珍稀野生動物的主要疫病之一。

犬細小病毒基因組長約5 000 nt，無囊膜，直徑約為26 nm，有兩種mRNA 啟動子和單一的多聚位點A，由結構蛋白(VP1、VP2 和VP3)和非結構蛋白(NS1 和NS2)組成病毒粒子。 從犬細小病毒變異過程發現，CPV 從CPV-2a、CPV-2b 到CPV-2c 都是在VP2 蛋白上發生重要氨基酸位點變異，導致病毒受體改變造成其感染多種宿主[4，5]。 近些年有學者陸續報道虎源、豹源、熊貓源及靈長類猴源FPV 和CPV 的感染，為我國的珍稀野生動物保護帶來巨大的威脅[3，6]。 因此本文對當前細小病毒感染多種動物的現狀進行綜述分析，以便為珍稀野生動物的保護提供基礎資料。

1 細小病毒的變異

犬細小病毒作為一種FPV 樣病毒，目前已出現CPV-2、CPV-2a、CPV-2b 和CPV-2c 等變異毒株，其基因變異率與某些RNA 病毒突變率相當[7]。 研究發現CPV-2 變異毒株不僅致病性增強，而且其可感染貓源細胞系CRFK 細胞，甚至可以在貓的多種器官復制增殖[8，9]。 CPV-2 多種亞型毒株VP2 基因發生多處變異，其中300 處氨基酸殘基的突變被認為是可以感染貓的主要原因，且經過連續傳代也同樣適應貓細胞系的培養。 因此，隨著CPV 的持續變異，宿主范圍也將不斷擴大，對犬、貓科等多種珍稀野生動物的威脅也在不斷提高。

2細小病毒宿主擴展機制

2.1 自然特異性適應 細小病毒幾種亞型毒株的出現，導致其自然特異性宿主發生改變。 然而，病毒的宿主改變機制仍然值得探索分析。 病毒變異的主要原因多為長時間的疫苗免疫壓力、因環境變化產生的自然選擇，病毒感染動物后發生基因重組等。 其中被廣泛認可的假說是通過感染中間宿主(貓科和犬科等肉食獸)致使基因發生變異而導致宿主擴展[10]。 有研究表明，在哺乳動物中有超過280 種食肉動物，其中可作為CPV 與FPV 的天然儲存宿主的動物仍然還很模糊，但眾所周知的是，野生食肉動物均可感染這兩種病毒。 通過進化分析可知，細小病毒在野生食肉動物和家養動物之間的傳播很可能是普遍且雙向傳播的。 因此有研究發現，浣熊細小病毒作為變異的CPV 株在未鑒定的宿主范圍內傳播流行將近24 年，同時對VP2 基因分析顯示，當前多數浣熊細小病毒作為CPV-2 和CPV-2a 的進化中間體[10-11]。 因此，細小病毒在傳播變異過程中發生宿主多重適應性轉變，而中間體很可能作為病毒多宿主轉移和進化的橋梁。

2.2 VP2 變異誘導宿主擴展 VP2 蛋白不僅是構成核衣殼的主要成分，同時也是抗原決定簇所在區域，VP2 蛋白可決定宿主選擇、受體結合等一系列感染過程。 近些年來細小病毒VP2 蛋白不斷變異，產生了較多的變異毒株同時也擴大了其宿主范圍。從FPV 到CPV-2c 期間VP2 蛋白共發生15 處氨基酸突變，VP2 蛋白300aa 位置的突變一直貫穿整個變異過程，VP2 蛋白最顯著的突變是300aa 處Gla突變為Asp 已經出現五次。 為了證明，VP2 300 突變對受體結合的影響，有研究通過生物層干涉測量法分析了FPV VP2 300-Asp 和300-His 突變體與重組貓TfR 的結合動力學，結果顯示，在VP2 300 處從Asp 突變為His 后FPV 與受體結合顯著增加，親和常數KD值300-Asp 為1.2 ×10-8M 和300-His 為4.06 ×10-9M 與繪制增長曲線數據一致，證明了VP2 300-His 突變體比300-Asp 突變體與貓TfR 結合的更緊密[12]。 有研究發現，從浣熊分離的CPVlike 病毒不能與犬的TfR 結合而不感染犬細胞，但是通過對浣熊CPV 毒株(Rac 118)在A72 細胞傳代培養，VP2 300 處由Asp(GAT)轉變為Gly(GGT)后，浣熊CPV 重新獲得了感染犬的能力。 該研究又對Rac 334 毒株培養發現VP2 300 Asp(GAT)轉換為Val(GTT)，同樣獲得了感染犬細胞的能力，針對浣熊細小病毒的研究發現，VP2 300 位氨基酸殘基處不同的突變，均能改變其宿主范圍，最終鑒定證實浣熊CPV VP2 300 位氨基酸的變化可使其感染犬、貓、雪貂和貂的細胞，從而擴大宿主范圍[13-14]。為了進一步揭示VP2 300 位如何影響病毒的感染，通過對Rac118(0 代300-Asp，20 代300-Gly)接種多種宿主動物包括家貓、犬和雪貂等細胞系，結果表明，0 代和20 代的Rac118 感染NLFk 細胞數量相當，與自然中貓科動物易感染浣熊和犬源CPV 的結果一致，并不因基因變異而影響。 但是將Rac118(20 代300-Gly)在犬細胞上傳代培養可導致雪貂細胞感染性顯著的增長，而與非傳代的Rac118 在A72和Mpf 細胞高度耐受相違背。 正常在犬細胞培養下，感染Rac118 與300-His 密切相關而不是300-Gly，預示浣熊源CPV 適應一個宿主后在傳代的不經意間使病毒更適應于另一種新宿主[13]。 VP2 300是CPV 中有最多的可變氨基酸的區域，該位點的不斷變異也使其可感染多種食肉動物，表明該位點是細小病毒在不同食肉動物間跨物種進化的重要決定因素[15]。 然而，調控VP2 300 位氨基酸的突變具體因素和不同的氨基酸變異是如何誘導其感染新宿主的機制仍不清晰，希望在未來研究中得以揭示。

2.3 轉鐵蛋白影響機制 轉鐵蛋白受體(TfR)是通過結合和內化轉運鐵載體的一種Ⅱ型跨膜糖蛋白[16]。 TfR 可通過pH 值介導鐵與轉鐵蛋白相互作用促進鐵的吸收與釋放，TfR 還有一個重要的功能是作為犬或貓細小病毒感染細胞的重要功能性受體，犬和貓體內轉鐵蛋白受體的結構差異決定了兩種病毒的宿主特異性。 有研究表明，細小病毒衣殼蛋白與TfR 的特異性相互作用的結合調控著細小病毒感染的宿主范圍，因此無論衣殼蛋白的變異還是TfR 的改變都會影響病毒宿主范圍的變化。 TfR 頂端結構域殘基的變化可影響著病毒的感染結合，而TfR 與衣殼蛋白的特異性結合很可能取決于特異性宿主和病毒結構的變化[17]。 當CPV 感染細胞時TfR 與衣殼蛋白的結合是通過網格蛋白介導胞吞實現的，并在低pH 值條件下在細胞系統內進行復雜的轉運。 因此，有研究為了確定TfR 結構與細小病毒衣殼蛋白結合的相互作用，改變了貓或犬TfR 的頂端結構域或者制備了這些受體的嵌合體，并檢測改變的受體與FPV 或CPV 衣殼蛋白的結合效果，結果顯示，貓TfR 的頂端結構域中的大部分變化不影響結合，但是用Ser 或Asp 取代Leu221 可阻止TfR與FPV 或CPV 衣殼蛋白結合，而用Lys 取代Leu221產生，僅結合CPV 但不結合FPV 的受體。 對貓和犬TfR 的重組體的分析顯示，控制CPV 特異性結合的序列在頂端結構域內，并且這些受體基因序列之間不止一個氨基酸的差異決定了犬TfR 與CPV 特異性結合[19]。 Palermo 等將昆蟲細胞表達的犬和貓TfR 純化后與CPV-2、CPV-2b 和FPV 衣殼蛋白進行互作，顯示貓的TfR 可與FPV 和CPV-2 衣殼蛋白緊密結合而與CPV-2b 結合的卻很弱，犬的TfR 與CPV-2、CPV-2b 的衣殼蛋白結合水平較低，與FPV衣殼蛋白幾乎不能結合，但是頂端結構域變異的犬TfR 卻可與CPV-2、CPV-2b 和FPV 衣殼蛋白結合，并可獲得與貓TfR 相似的結合水平，這暗示TfR 的變異也是改變細小病毒宿主的重要因素[20]。 實際上犬和貓TfR 氨基酸相似性可達89%，但犬TfR 與CPV-2 和CPV-2b 衣殼蛋白結合較弱及不能與FPV結合，主要取決于TfR 頂端結構域幾個氨基酸序列的差異，其中383 位和385 位犬TfR 氨基酸殘基變化可使其獲得與FPV 和CPV-2b 衣殼蛋白結合的能力。 而這幾個氨基酸殘基位點似乎在犬的TfR 上形成潛在的糖基化位點阻礙病毒感染，但是通過PNGase-F 去糖基化并不會使CPV-2 和CPV-2b 的衣殼蛋白與TfR 結合增強[12]。 因此TfR 頂端結構域的變化才是使細小病毒衣殼蛋白結合的主要決定因素，TfR 不僅管控著病毒的感染結合，同時也與病毒的致病機制等密切相關。

雖然細小病毒的衣殼蛋白與宿主TfR 結合對病毒的感染和轉運有著復雜的影響，但是幾乎沒有僅通過某種病毒新型變異株導致的自然宿主發生改變的案例，然而犬細小病毒卻成功突破自然宿主障礙獲得了利于病毒流行的新宿主。 貓和犬TfR 與CPV 和FPV 衣殼蛋白的結合為細胞感染提供了所需的特定結構作用，使FPV 成功通過自然選擇和基因突變實現了與犬TfR 結合的能力，并逐漸被CPV-2 的衍生毒株所取代[21]。

3 細小病毒跨宿主感染現狀

細小病毒在變異過程中不斷擴展其宿主范圍，改變其組織嗜性使其成為多種野生動物主要的致病源。 有報道表明，FPV 可感染多種自然野生的貓科動物如虎、獅和豹等珍稀動物[22]。 劉永相等從我國東北虎糞便中成功分離一株虎源細小病毒HRBT2014，并對其VP2 基因序列比對和進化分析表明，相比CPV 該毒株與貓源細小病毒相似性較高[23]。近些年有研究陸續發現，大熊貓也可感染細小病毒，在福州大熊貓研究中心分離出一株細小病毒，通過VP2 基因分析發現其為CPV[24]。 2008 年，我國學者從實驗動物養殖基地因腹瀉致死猴身上分離出一株病毒，經系統分離鑒定為細小病毒，經測序分析表明其與FPV 和CPV 核酸同源性分別為98.75%和98.15%，并發現10 個重要氨基酸位點中有8 個與FPV 相同，2 個與CPV 相同，最終認定為其FPV 變異毒株[25]。 FPV 與CPV 不斷變異引起宿主進化，嚴重影響著珍稀野生動物的安全，因此對細小病毒宿主進化機制的研究刻不容緩。

4 小結

FPV 和CPV 作為貓科和犬科的主要病毒，他們因其基因不斷的變異出現跨宿主感染，嚴重威脅著野生虎、豹和熊貓等珍稀動物的安全。 然而，細小病毒的宿主進化機制的研究主要以VP2 蛋白300 位的變異和TfR 頂端結構域幾個氨基酸的調控為主，但是其具體如何通過基因突變或TfR 調控導致抗原性、組織嗜性和宿主范圍的改變仍然值得探索。 隨著細小病毒研究的不斷深入，希望在不久的將來能揭開其宿主進化機制，為病毒防控提供有效方案。