生物活性肽制備及其在糧油中的開發

陳文雅，譚云

(國家糧食局科學研究院，北京 100037)

生物活性肽是眾多生物活性成分中的重要一員，屬蛋白質片段，除了營養功能外其對機體功能或狀態有一定的調節作用，通過作用消化系統、內分泌系統、心血管系統、免疫系統和神經系統等影響機體健康。肽種類繁多，按來源可分為內源性生物活性肽和外源性生物活性肽，按功能可分為生理活性肽和食品感官肽。目前，已得到多種活性肽，如抗氧化肽、降血壓肽、抗菌肽、抗血栓肽、降膽固醇肽、阿片樣肽、提高礦物質吸收或其生物活性的肽、細胞生長調節肽、免疫調節肽、減肥的肽、抗遺傳毒性的肽[1]。雖然對活性肽的研究較多，但只有極少部分活性肽真正進入市場，原因很多，其中重要的一點是活性肽制備難以實現規范化、規模化生產，產品活性保留檢測和功能鑒定耗時耗材。

活性肽制備來源廣泛，涵蓋動物、植物、微生物[2]，可以直接從生物體中分離得到天然活性肽，如可從苦瓜[3]、鴕鳥[4]、人腦皮層組織[5]等物質中分離出各種生物活性肽，也可以通過酶解法、微生物發酵法、化學合成法、生物工程法等技術生成。天然活性肽安全、高效、低毒，但生物體中的活性肽一般很少，原料數量要求大，分離技術復雜，成本高，在食品中的應用受限。人工制備的活性肽因其產物復雜難以純化，阻礙了活性肽制品的市場形成。目前，從食源中獲得生物活性肽主要采用酶解法和微生物發酵法，工藝流程一般為:原料(預處理：粉碎、各種溶劑溶解后離心取上清或懸濁液等)—酶解反應/微生物發酵(優化工藝參數)—檢測活性—離心干燥，研究中常用單因素實驗結合正交實驗或響應面分析方法優化工藝參數。關于生物活性肽方面的綜合報道較多,但大多集中在其活性功能方面，鮮有文獻對其制備方法進行整體分析，不利于活性肽的深入研究與工業化，本文綜述了各種制備方法在活性肽中的應用，尤其是在糧油源肽中的開發應用，以期為各類活性肽的深入研究及工業化生產提供一定的參考價值。

1 酶解法

活性肽一般以非活性狀態存在于蛋白質中，只有在適當條件下降解成中小分子后才有生物活性。在蛋白質酶解過程中，部分起關鍵活性作用的氨基酸序列將得到保護，在將周圍的成分降解后，這些活性成分被釋放出來從而發揮生理功能。酶解法應用較多，技術成熟、安全、成本低，生產條件溫和，對原料中的營養價值破壞小，且所得肽品溶解性好、耐酸、耐堿等，已成為生物活性肽最主要的生產方式[6]。Gibbs B F等[7]以大豆水解物和大豆發酵食品為原料,選擇多種蛋白酶(鏈霉蛋白酶、胰蛋白酶、Glu C蛋白酶、血漿蛋白酶和腎臟膜蛋白酶)酶解,得到的寡肽具有ACE抑制活性、抗血栓、表面張力、抗氧化活性等。

酶解法中常用的酶包括胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、復合蛋白酶(Protamex)、黑曲霉酸性蛋白酶等[8-10]，使用多酶組合可提高肽制備效率和品質，如榨油后的苦杏仁蛋白經風味蛋白酶與堿性蛋白酶雙酶組合水解后得到的肽對DPPH自由基、羥基自由基、超氧負離子清除能力較好，表現了很好的抗氧化性。酶種類的選擇對于產物的生理活性有重要影響，趙濤[11]以葵花籽粕球蛋白為底物，通過堿性蛋白酶或木瓜酶酶解可制備抗氧化肽，而通過中性蛋白酶酶解可制備降血壓肽。產物的分離過程對生理功能也有較大影響，分離方法(如吸附分離技術、膜分離技術、色譜分離技術、電泳分離技術等)的選擇直接影響產物的性質。郭浩楠[12]以鰱魚蛋白為原料，采用堿性蛋白酶進行酶解，所得4種不同水解度的酶解物的抗氧化能力均較原料明顯提高，再將優化得到的酶解物進行超濾、凝膠柱分離純化，制備ACE抑制肽，可用于開發具有降血壓功能的食品或藥品。酶解時間對所得蛋白水解產物的營養、抗氧化活性、功能特性都有影響[13]。

在酶解過程中疏水性氨基酸殘基暴露，使得產物有苦味，難以被消費者接受。通過物理吸附作用，如添加吸附劑活性肽、硅藻土等可脫苦；通過乙醇、丙醇、丁醇等醇提或者β-環糊精、多磷酸鹽、明膠等絡合處理酶解物可去除苦味肽[6]。但脫苦處理工序復雜，目的產物損失多，成本高，影響其在食品中的應用[8]。采用多酶法或微生物發酵法可有效去除或改善水解產物肽的苦味。陳亮[14]采用乳桿菌對蛋白水解液進行發酵后，酶解液的苦味值下降了75%。蛋白酶特異性弱，定向酶解是酶解法制備生物活性肽的一大技術難點，酶解產物組成復雜，不易提純。將酶解法與其他方法適當地結合起來可更有效生產生物活性肽，如將酶解法與高效液相色譜法結合生產風味肽[15]、酶解法與微生物發酵法結合可去除肽產物中的苦味等。

目前在酶解法制備活性肽的研究領域，除了酶的篩選、酶解工藝優化外，還應關注原料預處理、產物分離純化、產品加工中的活性保護等，已有學者對酶解反應器、固定化酶、可控酶解等開展研究以期提高酶解法肽制備效益。表1列出了近幾年國內外采用酶解法制備活性肽的研究情況。

表1 不同原料酶解法制備活性肽

2 微生物發酵法

微生物發酵法是通過蛋白酶產生菌對蛋白原料作發酵處理，分離純化目的活性肽的過程，其本質也是利用蛋白酶酶解蛋白，但該法是直接利用微生物產酶水解蛋白源，減少了制備酶的成本，且酶的種類豐富，可以滿足多種酶解過程的需要。發酵過程中產生的活性肽可能會影響微生物的生長代謝，進而反過來影響生物活性肽的生成。作為新型生物活性肽制備方法，微生物發酵法具有較多優勢，如微生物來源廣、繁殖快、酶產量高、含有多種酶可去除肽制品苦味、生產效率高、成本低。但從工藝上來說，微生物發酵法在效率和分離純化方面都不如酶水解法[10]。微生物發酵產物純化困難，很多產酶菌株對機體有毒，限制了該法的應用。目前采用的菌株主要有枯草芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉等[6,8]。

微生物產生的端肽酶能修飾小肽末端，可去除酶解法所得肽的苦味與異味[28]。微生物發酵法與酶解法相結合，可提高肽的生產效率。研究發現利用乳桿菌對蛋白酶解液作進一步發酵處理，水解度可提高34.6%[14]。同多酶酶解法類似，發酵法也可采用雙菌種或多菌種，能更高效地生產活性肽[29]。表2列出了近幾年國內外采用微生物發酵法制備生物活性肽的情況。

表2 不同原料微生物發酵法制備活性肽

3 其他制備方法

利用不溶性樹脂，將不同的氨基酸通過酯鍵相連延伸制成多肽，即為固相多肽合成法，是化學合成肽類的經典方法，但該法所用試劑毒性大、耗時、成本高、所得肽鏈短、效率低[8]。將固相多肽合成法制備的短鏈通過液相合成法形成長肽鏈，即片段連接法，可改善固相合成法的部分缺點，但這樣會使產物的純化工作困難[6]。化學合成法主要用于生產作為藥物的活性肽。

有研究者利用分子生物學制備活性肽。如將可表達目標肽的基因片段整合到生物體中，載體生物體直接表達目標肽[38]，但該類方法還不夠成熟、技術設備要求高、成本高，且基因重組方法易形成包涵體，不易合成目標肽。簡單的酸解降解蛋白質也可制備生物活性肽，但易使肽產物受損，且副產物多，純化困難。多種制備方法相結合的方法，能更有效地制備肽。

昆蟲也可以用來制備肽。昆蟲的食源很廣泛，這是由于其多變的酶系統，有些是昆蟲自身產生的酶，而有些由相關微生物提供[39]。已分離出幾種谷物害蟲，它們對小麥或大米中的儲藏蛋白有分解作用，其中谷蠹具有較強的能分解脯氨酰的肽酶。通過陰離子交換色譜法對谷蠹提取物進行處理，純化肽酶，得到肽酶片段，能分解小麥和大麥中的肽[39]。昆蟲中這些酶系統或許可以用來工業化生產蛋白水解物。

4 產物純化與鑒定

無論采用哪種方法制備生物活性肽，分離純化都是獲取高活性產物的重要步驟，目前常用的方法有離子交換層析法、高效液相色譜法、超濾法、凝膠過濾柱層析法、毛細血管電泳法、反滲透法、膜分離法等[15]。于志鵬等[23]采用交聯葡聚糖凝膠色譜純化蛋清蛋白酶解物得到高活性肽，并通過液相色譜四極桿線性離子阱串聯質譜(Q TRAP)鑒定肽片段結構。Rafik Balti等[40]經葡聚糖凝膠G-25排阻色譜法將烏賊蛋白水解產物分離出8個片段，再通過反相高效液相色譜(RP-HPLC)對其中具有高活性的肽片段進行分離純化，采用ESI-MS和ESI-MS/MS對得到的ACE抑制肽進行測序。Sang-Hoon Lee等[27]采用超濾膜生物反應器系統分離金槍魚蛋白酶解物，得到3種分子量物質，其中將ACE抑制活性最高的成分進一步純化，得到由21個氨基酸組成的ACE抑制肽。Alain Doyen等[21]依靠不同的超濾膜通過電滲析得到亞麻籽蛋白酶解物分離物，并評估了這種方法對肽遷移、分離特性的影響。短肽因不易被消化酶降解，更易在機體中發揮生理功能，但目前短肽分子的鑒定依然比較困難，time-of-flight ESI-MS/MS可有效分離和鑒定短肽，或可廣泛地用于食源肽中小分子肽序列的鑒定[41]。如何將肽生成過程與分離純化過程有效結合起來，提高生產效率與肽制品活性，是該領域需要解決的重點。

5 肽制品在糧油中的開發

肽制品來源多種多樣,食品源中最大的一類當屬糧食源,不僅來源廣泛、數量多，而且因人們長期食用糧食，糧食中提取的肽對人體的副作用較少，對糧食源肽制品進行深入開發有重要意義。糧食包括谷物、豆類、薯類,我國常見的糧食作物包括稻米、小麥、玉米、大豆、紅薯等。糧食加工產品主要為主食、食用油，加工副產物中含有豐富的蛋白質，一般用作飼料蛋白，附加值較低，資源浪費嚴重。研究表明，稻米、小麥、玉米、大豆等糧食作物中含有多種生物活性成分，如多酚、黃酮、多糖、活性肽等，其中活性肽種類繁多，功能多樣，是營養學家的研究熱點。

米渣中含有約60%的蛋白質[42]，來源廣、價格低廉，是良好的肽加工原料,米肽具有抗氧化、降血壓等作用。Jiwang Chen[43]等通過純化從大米蛋白水解物中分離出ACE抑制肽,有望用于功能性食品或抗高血壓藥物。趙強等[44-45]以米渣為原料，通過酶解法制備米肽，但由于酶法水解物中含有大量短肽，影響產物的乳化性和穩定性，研究者將米肽與葡萄糖進行濕法接枝反應，所得米肽—葡萄糖接枝物較米肽在乳化性、抗氧化性方面明顯得到改善。我國是世界上最大的小麥生產國，小麥資源豐富，小麥主要作為主食，目前為止對其副產物的開發較少，具有較大的開發潛力。代卉等[46]研究發現經堿性蛋白酶降解小麥蛋白得到的小麥肽對應激狀態引起的機體抗氧化體系紊亂和免疫降低有調節作用。有研究報道，含小麥肽的飲料可以緩解大負荷運動訓練造成的肌肉損傷，加快運動性疲勞的恢復[47]。國外研究發現麥麩自溶肽LRP和LQP可以改善非酒精性脂肪性肝炎相應指標，或可用于生產非酒精性脂肪性肝炎的治療劑[48]。小麥胚芽還是谷胱甘肽的重要來源,可用于不同類型功能食品的制作。作為三大主糧之一，玉米的產量也不容小覷，但就目前國內消費市場來看，供遠大于求，對玉米進行營養學研究，不僅能促進玉米產業發展，緩解市場壓力，還能提高生活品質。有學者以玉米蛋白粉為原料，通過生物酶解、膜分離及冷凍干燥等技術制備玉米肽，再通過進一步研究開發出一種肽飲料，能輔助增強記憶[49]。另有研究報道，玉米蛋白通過酶解得到低聚肽，其對肝損傷有較好的保護作用，還能為肝細胞提供能量，可研究開發成保肝產品[50]。

大豆是一種常見蛋白來源，大豆油脂生產副產物大豆粕，其蛋白含量高且氨基酸比例比較平衡。在所有的糧油產品中,對大豆產品的開發最為廣泛,對大豆肽的研究和應用也最為深入。研究表明大豆肽有多種生理功能，如免疫調節、抗血栓、抗高血壓、體重控制等,可開發應用到醫學領域，如治療糖尿病、增強大腦功能等[51-52]，大豆肽還具有抗疲勞、抗氧化、提高膠原蛋白等作用，可用于化妝品中以提升皮膚水分和彈力[53]。Lunasin是一種大豆源生物活性肽，廣泛存在于所有大豆品種中，含有40多個氨基酸，具有抗氧化、抗炎、抗癌作用，對機體內膽固醇的生物合成具有重要的調節作用，且具有熱穩定性，是最有開發前景的一種大豆肽[54-57]。大豆蛋白水解產物還可作為原料制備肉味香精[58]。其他豆類也有一定的開發價值，如蕓豆蛋白通過堿性蛋白酶酶解制備的活性肽具有抗氧化性和ACE抑制性[59]，胃蛋白酶和胰酶作用于鷹嘴豆蛋白生成的肽具有促進礦物元素吸收的作用[17]。

由表1和表2可知，其他糧油原料，如花生、亞麻籽、油菜籽等均可用于生物活性肽的制備，研究利用糧油副產物開發肽制品或可大幅提高糧油產業的附加值。目前，對糧食源肽的研究報道較多，但有明顯的偏向性，主要研究豆源活性肽，其他糧油源活性肽的開發潛力仍較大。

6 小結

目前已有小部分肽制品上市，大多數肽制品還停留在實驗室階段。雖然食源活性肽被證明有多種生理功能，但是這些功能大部分是通過體外實驗被證實，缺少臨床證據，而一種食源肽能否真正產生生理活性則依賴于其活性結構到達靶組織的能力。要想將活性肽實現商業化和工業化生產，必須使肽產品的分析方法標準化，包括產品質量分析、感官評價以及能很好支持其健康功能的臨床實驗等。因此，肽制品的研發還需深入細胞、體內實驗，對于活性結構的保護加工也需重視。糧油及其加工副產物產量大，經濟效益低，且對環境有較大的影響，通過對肽制品的進一步研發可降低糧油加工副產物對環境的污染、提高糧油加工產品的附加值，是提高糧油經濟效益的有效途徑。

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