分子熒光雙標準夾心法快速測定食品中的鋁

高向陽，楊夢柯

(鄭州科技學院食品科學與工程學院，河南 鄭州 450064)

鋁是自然界含量較多的金屬元素[1]，廣泛存在于食品中，在人體內能與多種蛋白質或酶發生化學反應，影響人體正常功能，使大腦骨骼受到損害，導致神經系統無法正常運轉，甚至造成記憶力和智力下降[2]，進而引發阿爾茨海默癥、帕金森綜合癥、老年癡呆癥[3]等神經系統疾病。世界衛生組織(WTO)已將鋁確定為食品污染物之一，GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》明確規定了面制品中含鋁食品添加劑的用量、殘留量和使用范圍[4]，我國已經進入老年社會，因此，建立快速、簡便、準確測定食品中鋁的新方法對維護人體健康有一定的現實意義。

目前，測定鋁的方法主要有石墨爐原子吸收法[5]、高效液相色譜法[6]、電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS)[7]、ICP-AES[8]、示波極譜法[9]等，這些方法儀器昂貴、成本高，操作麻煩、分析時間長，或需繪制標準曲線和測定空白溶液，計算較為繁瑣復雜。熒光分析法靈敏度較高、線性范圍廣、選擇性較好、操作簡單快速，已得到實際應用[10]，雙標準夾心法也稱雙標準比較法或緊密內插法[11]，該法利用濃度大(ρ1)、小(ρ2)的兩個標準溶液，將待測試液(ρX)夾在其中，要求ρ1>ρX>ρ2。在相同體積的萃取液中，可簡便的用質量代替濃度。在相同條件下，濃度或質量與發光信號呈正比，依此進行定量分析，該法已在環境監測中有所闡述[12]，但雙標準夾心法在發光分析領域尤其用分子熒光法測定食品中的鋁至今未見文獻報道。本實驗根據8-羥基喹啉與三價鋁在一定條件下定量形成強熒光配合物的特性，用雙標準夾心法定量。該法試劑易購、樣品用量少、無需繪制標準曲線和測定空白值、快速簡便，為食品中鋁的測定提供了一種全新的分析技術，具有一定的推廣應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

紫麥和賊小豆：采自鄭州市郊；油條：購自鄭州市早餐攤點。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

硝酸、濃氨水：洛陽昊華化學試劑有限公司；高氯酸：天津市鑫源化工有限公司；氯仿：河南省新鄉市中原有機化工有限責任公司；8-羥基喹啉：北京化工廠；冰醋酸：天津市致遠化學試劑有限公公司。均為分析純。1 000 μg/mL鋁標準溶液：購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；實驗用水為怡寶純凈水，電導率為2.28 μS/cm。

100 μg/mL鋁標準溶液儲備液配制 準確移取1 000 μg/mL的鋁標品5.00 mL于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度。

鋁標準使用液配制 采用逐級稀釋法，將100 μg/mL的鋁標準溶液儲備液稀釋為質量濃度為10、1、0.2 μg/mL等鋁的標準使用液。

200 μg/mL 8-羥基喹啉溶液配制 準確稱取0.100 0 g的8-羥基喹啉(分析純)于小燒杯中，加入3 mL冰醋酸，轉移至500 mL容量瓶中，用水定容。

6 mol/L氨水配制 取45 mL 25%的濃氨水加水稀釋至100 mL。

1.2.2 主要儀器

FW-80型萬能粉碎機：北京市永光明醫療儀器有限公司；pHS-3C型臺式酸度計、970CRT型熒光分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；SW-TFG12型通風柜：鄭州宏朗儀器設備有限公司；DZF-6050A型真空干燥箱：北京中興偉業儀器有限公司。

所有玻璃儀器都要事先用30%硝酸浸泡過夜，用蒸餾水洗凈后方可使用。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

紫麥、賊小豆分別用研缽研碎，油條剪碎，置于稱量瓶中，在104 ℃烘箱內烘至恒重，于干燥器中保存。稱取樣品0.200 0 g(準確至0.000 1 g)于100 mL錐形瓶中，加入10 mL硝酸-高氯酸(4+1)混合酸，蓋上小漏斗，在通風櫥中消解冒白煙近干時取下，加2 mL水繼續加熱，待溶液澄清透明取下冷卻后，全部移至25 mL容量瓶中，用水定容、搖勻，此為樣品分析液。

1.3.2 雙標準溶液配制

準確吸取1 μg/mL的鋁標準使用液0.10 mL于100 mL燒杯中，加入20 mL水、200 μg/mL 8-羥基喹啉溶液5.00 mL，搖勻，用6 mol/L氨水調節pH 7.60后倒入分液漏斗中，取5 mL氯仿潤洗燒杯后倒入漏斗中萃取，取下層液體于10 mL具塞比色管中，再取5 mL氯仿萃取1次，合并下層萃取液后用氯仿小心定容，搖勻后待測定，此為10 mL氯仿萃取液中含鋁0.10 μg的稀標準溶液；同理，準確吸取1 μg/mL的鋁標準使用液3.00 mL于100 mL燒杯中，按照以上操作配制10 mL氯仿萃取液中含鋁3 μg的濃標準溶液，搖勻待測。

1.3.3 試液制備和測定

準確吸取樣品分析液1.00 mL于100 mL燒杯中，加入20 mL水、200 μg/mL 8-羥基喹啉溶液5.00 mL，搖勻，以下操作和萃取同1.3.2雙標準溶液，在儀器設定的相同條件下，完成雙標準溶液和試液的測定。按(1)式計算10 mL樣品氯仿萃取液中鋁的質量mx。

(1)

式中，mx為樣品氯仿萃取液中鋁的質量，μg；Ix為樣品mx的相對熒光強度；m1、m2分別為濃標準、稀標準氯仿萃取液中鋁的質量，μg；I1、I2為濃標準、稀標準氯仿萃取液的相對熒光強度，I1>Ix>I2。

由(1)式可知，(m1-m2)/(I1-I2)為單位熒光發射強度所相當的氯仿萃取液中鋁的質量。很顯然，在相同條件下測定，此值乘以(IX-I2)即是樣品氯仿萃取液比稀標準氯仿萃取液中多的鋁的質量數值，依據此比例關系，可以簡便的實現快速測定。同時，按(2)式計算樣品中鋁的質量分數：

w/(mg/kg)=mx×25/m

(2)

式中,w為樣品中鋁的質量分數，mg/kg；m為稱樣量，g;25為樣品分析液定容的總體積，mL。

1.3.4 樣品標準曲線法的測定

分別吸取1 μg/mL的鋁標準使用液0.00、0.10、0.40、0.80、1.00、2.00、5.00、8.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00 mL于100 mL燒杯中，各加20 mL水和200 μg/mL 8-羥基喹啉溶液5.00 mL，用6 mol/L氨水調節pH 7.60后，倒入分液漏斗中，以下按1.3.2萃取操作。以10 mL氯仿萃取液中Al3+的質量(μg)為橫坐標，熒光相對強度為縱坐標繪制標準曲線，如圖1。由圖1可知，線性回歸方程為y=3.845x+29.908，相關系數r=0.999 0。

在與標準曲線相同的條件下測定樣品分析液，同時測定空白，由標準曲線或回歸方程求出10 mL氯仿萃取液中Al3+的質量。

圖1 8-羥基喹啉鋁的標準曲線

2 結果與分析

2.1 儀器工作條件

最大激發波長EX為400 nm；最大發射波長EM為525 nm；掃描速度為低速；靈敏度為1；EX狹縫為10 nm；EM狹縫為10 nm。

2.2 pH的影響

取12個100 mL的燒杯，各加人20 mL水，0.2 μg/mL的鋁標準使用液2.00 mL，200 μg/mL 8-羥基喹啉5.00 mL，用6 mol/L氨水調節pH分別調為4.00、5.00、6.00、7.00、7.30、7.60、7.90、8.00、8.20、8.50、8.80、9.00，分別倒入分液漏斗中，取5 mL氯仿潤洗錐形瓶，以下按1.3進行操作、測定，結果見圖2。由圖2可知，pH為7.60時熒光相對值最大且基本穩定，與相關文獻報道[12-14]結論一致。

圖2 pH對鋁—8-羥基喹啉絡合物熒光強度的影響

2.3 最大波長選擇

吸取0.2 μg/mL的鋁標準使用液1.00 mL，置于含有20 mL水的錐形瓶中，再加入5 mL 8-羥基喹啉溶液，調節pH為7.60，用10 mL氯仿萃取，以下操作同1.3.2。固定EM發射波長510 nm[12]，設置EX為250～800 nm，在2.1其他條件下掃描，由圖3可知，最大激發波長為400 nm；固定EX激發波長為400 nm，設置EM為250～800 nm掃描，由圖4可知最大發射熒光波長為525 nm。最大波長各文獻報道的均略有差異[10,13-14]，本實驗亦是如此，可能與儀器誤差有關。

圖3 鋁—8-羥基喹啉絡合物的激發光譜

圖4 鋁—8-羥基喹啉絡合物的熒光發射光譜

2.4 萃取次數對熒光強度的影響

取5個100 mL燒杯，分別加20 mL水、0.2 μg/mL的鋁標準使用液2.00 mL，8-羥基喹啉5.00 mL，用氨水調節pH 7.60后，1號溶液用10 mL氯仿萃取1次，2號溶液用10 mL氯仿分2次萃取，依次類推，每次萃取操作與步驟1.3.2相同，實驗結果如圖5。由圖可知，10 mL氯仿萃取2次后測定的相對熒光值最大，效果最為理想。

圖5 萃取次數對鋁—8-羥基喹啉絡合物熒光強度的影響

2.5 絡合反應時間的影響

向7個燒杯中各加20 mL水，0.2 μg/mL的鋁標準使用液2.00 mL，200 μg/mL 8-羥基喹啉5.00 mL，用6 mol/L氨水調節pH 7.60后,馬上計時，設定反應時間分別為0.0、5.0、10、20、30、40、50 min，按1.3操作萃取后測定，實驗結果如圖6。

圖6 反應時間對熒光強度的影響

由圖6可知，絡合反應時間對測定影響不大。

2.6 測定結果及精密度

按實驗方法，在儀器工作條件下，用雙標準夾心法和標準曲線法對照測定，各樣品分別進行5次平行測定，檢驗無可疑值后報告，測定結果和標準偏差S、相對標準偏差RSD見表1。

表1 測定結果及精密度(n=5)

測定結果表明，油條鋁含量最高，其次是紫麥和賊小豆。按照文獻[15]對2種方法進行顯著性檢驗，通過F檢驗和t可知，2種分析方法不存在顯著的偶然誤差和系統誤差，結論的置信度為95%。

2.7 檢出限與定量限

對0.1 μg/mL鋁標準溶液，用實驗方法和儀器條件進行11次平行測定，按3倍標準偏差計算的檢出限0.030 μg/mL，按10倍標準偏差計算的定量限為0.10 μg/mL。

2.8 加標回收率

以紫麥和賊小豆為樣品，分別加入0.50、2.00、10.00 μg的鋁標準使用液，按實驗方法進行操作，在儀器工作條件下進行加標回收率實驗。結果見表2。

表2 加標回收率結果

由表2可知，雙標準夾心法的回收率在96.0%～107.2%之間。

3 結論

用雙標準夾心法定量測定食品中的鋁，無需繪制標準曲線，避免了作圖誤差和時常校正標準曲線所帶來的諸多不便。由計算公式(1)可知，所用標準溶液濃度處于試液的濃度左右，本法在完全相同的條件下，測定的是熒光信號差值所相當的濃度差值，8-羥基喹啉空白微弱的熒光信號在測定中已經予以扣除，無需再重復測定空白。該法簡便、快速，結果計算簡單，精密度和回收率較為理想。在儀器工作條件下，方法測得的檢出限為0.030 μg/mL，定量限為0.10 μg/mL，回收率在96.0%～107.2%之間，相對標準偏差<1%。與工作曲線法對照測定樣品，經F和t檢驗表明，2種方法間的測定結果不存在顯著性差異，結論的置信度為95%，為食品中鋁的快速測定提供了科學參考。

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