化學發光免疫分析在調味食品原料安全檢測中的應用

劉享享，蘭文軍

(齊魯工業大學(山東省科學院) 生物工程學院， 濟南 250353)

化學發光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)是將靈敏度較高的化學發光反應和特異性結合較強的免疫反應相聯合產生的一種分析方法，其最初的理論基礎來源是放射免疫分析[1]?；瘜W發光根據其本身具有熒光的特征，在無激發光存在的情況下仍可以產生熒光信號，從而避免了熒光收集時激發光中散射光的影響。除了具有高特異性、高靈敏度以及寬線性檢測范圍的顯著優點外，化學發光免疫分析所需要的檢測儀器簡單、操作方法方便、不具有放射性污染且易實現自動化,節省時間等一系列的優勢[2-6]，逐漸得到各科學領域的廣泛關注和研究應用，尤其是在調味食品原料安全的快速檢測中得到越來越多的應用。

1 化學發光免疫分析的基本原理

化學發光免疫分析，是將免疫反應和化學發光檢測相結合而產生的[7]。免疫反應部分主要是抗原或抗體與報道標記物結合后，通過特異性免疫反應，產生抗原-抗體復合物的過程。化學發光檢測指報道標記物與相關催化劑的反應,首先形成一個中間物質，處于一種激發態,從激發態到達基態的中間物質會釋放出一系列光子或電子，最后通過專門的信號收集儀器計算出光量子的產出率[8]。

2 化學發光免疫分析方法分類

化學發光免疫分析的分類標準存在著較大的差異，目前主要依據各種方法本身借助的報道標記物質的差異，分為采用具有發光能力的化學發光劑對抗原或抗體直接進行標記的化學發光免疫分析(直接法)；另一類是將化學發光劑作為酶促反應底物的化學發光酶免疫分析；以及在電極表面進行的電子得失的電化學發光反應稱為電化學發光免疫分析。

2.1 化學發光免疫分析(直接法)

化學發光免疫分析(Chemiluminescent Immunoassay,CLIA)又稱為直接法檢測，利用具有發光功能的化學類物質和抗原或抗體直接反應，隨后在一系列的生理生化反應中達到檢測目的的免疫分析方法。常見的報道標記物有吖啶脂，但吖啶脂由于熱穩定性不好，目前常用吖啶脂衍生物作為報道標記物。吖啶脂衍生物具有發光能力的技術原理為：在含H2O2的堿性溶液中，吖啶脂衍生物作為報道標記物發生由激發態到基態的轉變，產生一定的光子而被檢測器捕獲。吖啶脂衍生物標記的化學發光免疫分析發光系統簡便、檢測速度快，無需催化劑的加入，且標記效率高，本底低，但此類閃光型化學發光對儀器要求較高。

2.2 化學發光酶免疫分析

化學發光酶免疫分析(Chemiluminescent Enzyme Immunoassay, CLEIA)是在酶類物質作為報道標記物的情況下，與加入的抗原或抗體產生帶有酶標記的復合物，然后與底物反應而產生化學發光，在專門儀器中收集發光信號。辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)和堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)是目前使用比較普遍的標記酶，它們具有各自特定的發光底物。

魯米諾及其衍生物作為HRP的主要發光底物，利用HRP與抗原或抗體發生免疫反應產生復合物，將魯米諾或其衍生物質在堿性環境H2O2參與下，生成激發態中間體，當其回到基態時產生光子，其中HRP的量也影響信號強度。金茂俊等[9]認為此傳統化學發光體系為幾秒內瞬時閃光，產生的光強度相對較小，從而會導致測量時難度大，如果加入化學發光增強劑可顯著提高發光信號,穩定發光的時間明顯延長,從而增強此反應體系的檢測靈敏性和準確度。1，2-二氧環己烷作為目前ALP的發光底物，應用較為普遍。Bronstein等[10]發現的3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環乙烷二鈉鹽(AMPPD)-ALP發光體系是該化學發光體系中主要選擇的體系。這一化學發光反應體系的特點是反應速度快，發光時間相對較長，對檢測儀器要求稍低，短時間可提供檢測結果。

2.3 電化學發光免疫分析

電化學發光反應與免疫分析方法相互融合而產生的一類更加方便、快捷的檢測分析方法稱為電化學發光免疫分析方法(Electrochemiluminescent Immunoassay,ECLIA)。該方法是通過電極表面所產生的電子的得失而發生的一系列反應，而其他化學發光是通過化合物之間彼此作用激發發光反應的進行。三聯吡啶釕[Ru(byp)32+]為電化學發光免疫分析常用的發光底物,主要通過三丙胺(TPA)的激發促使發光反應的產生。Ru(byp)32+和TPA在陽極同時失去電子，發生氧化反應。其基本原理為：二價的[Ru(byp)32+]被氧化成三價的[Ru(byp)33+]，同時TPA也被氧化成了陽離子自由基(TPA+*)，TPA+*通過自身質子的釋放變成了不穩定的TPA*，并將一個電子傳遞給三價的[Ru(byp)33+]而使之變成激發態的二價[Ru(byp)32+*]；二價的[Ru(byp)32+*]衰減釋放出光子，再次回到基態形式的[Ru(byp)32+]。通過這種方式可以在短時間內發出穩定的光，且在電極表面反復進行，發光強度不斷增強。

3 化學發光免疫分析(CLIA)在調味食品原料安全檢測中的應用

中國對于調味食品的探索和食用有著悠久的歷史，可以說調味食品在我們的日常生活中起著重要的使用價值。伴隨著化工合成添加物質在食品中的發展，調味品生產行業也蓬勃發展。但是，調味食品在快速發展的同時，也存在著不少問題，尤其是原料安全檢測方面。比如，釀造類和鮮菜類調味品中原料的農藥殘留，水產類調味品中抗生素的不當使用等，嚴重損害著消費者的利益和身體健康。因此，選用快速、高效的檢測技術是至關重要的。

3.1 調味食品原料中藥物殘留檢測

調味食品中的藥物殘留最主要的原因是在原料加工時未進行嚴格有效的把控，從而產生一系列的食品安全問題，所以對于調味食品原料的檢測尤為重要。傳統調味食品原料中農藥殘留的檢測方法主要有色譜、質譜以及高效液相等，但是操作步驟復雜，儀器昂貴，對實驗條件要求也很高。而化學發光免疫分析操作步驟簡單、性價比高、特異性好等優點，可以彌補其他檢測方法的不足。

食醋是一種酸味調味品，隨著工藝的不斷改進，飲料型食醋是目前比較受消費者歡迎的產品。而對于原料(如各種水果以及水源)的監控也是重中之重。2017年，Ding等[11]將化學發光酶免疫分析方法進行了改進，實現了對食醋原料蘋果和梨中煙堿類農藥氯噻啉的快速檢測，其線性范圍為0.13～5.84 ng/mL，半定量檢測抑制中濃度(IC50)為0.86 ng/mL。與建立的噬菌體酶聯免疫分析方法相比，其方法檢測的線性范圍更寬，靈敏度更高，與高效液相色譜結果顯示良好的相關性。2012年，Jin等[12]利用化學發光酶免疫分析方法實現了環境中三唑磷農藥的檢測,檢測范圍為0.04～5 ng/mL,對水和土壤的添加回收率分別為117.2%和122.0%。

在一些風味飲品中也需要一些調味食品，從而起到提升口感的作用。比如奶精可以使飲品口感更加順滑，奶精的原料可以從動物乳制品濃縮而成，而這些原料中殘存的獸藥可以危害到消費者的身心健康。隨著化學發光免疫分析方法高靈敏、可多種藥物同時檢測的優點顯現,一些奶制品獸藥的檢測也得到進一步拓展和深化。Luo等[13]利用化學發光酶免疫分析方法，在2016年成功檢測出牛奶中新霉素的含量，最低檢測限為9.4 μg/kg，靈敏度為2.4 ng/mL，其中添加樣標本平均回收率為88.5%～105.4%，與液相色譜-質譜法進行比較具有較高的相關系數。2014年，Tao等[14]基于化學發光免疫分析方法，實現了牛奶中氯霉素和鹽酸克侖特羅的雙重檢測，牛奶樣品中氯霉素和鹽酸克侖特羅的靈敏度分別為0.00501，0.0128 μg/L，結果明顯優于商業的酶聯免疫分析試劑盒。

3.2 調味食品原料中違禁添加物檢測

除藥物殘留外，調味食品原料中還含有一些危害人體健康的添加物，如俗稱“瘦肉精”的鹽酸克侖特羅，主要作為飼料中常用的調味劑。消費者食用了殘留瘦肉精的肉就有可能產生一系列的不良反應比如頭疼、四肢麻木、心悸等。目前化學發光免疫分析方法在克倫特羅、沙丁胺醇、嗎啡等違禁添加物檢測中表現出較高的靈敏度，該方法的應用價值也將會得到顯著提升。

2013年，Yao等[15]基于電化學發光免疫分析方法，建立了克倫特羅的快速檢測，檢測限為0.02 ng/mL，線性檢測范圍為0.05～1000 ng/mL。2015年，Cai等[16]利用電化學發光免疫分析方法，建立了沙丁胺醇的免疫分析檢測，檢測線性變化范圍為0.05～500 ng/mL，檢測下限為0.017 ng/mL。2012年，杜海平[17]建立了金磁微粒和化學發光免疫分析相結合的嗎啡的免疫檢測方法，結果顯示IC50為63 ng/mL。此方法可以快速地檢測食品中是否含有違禁調味食品罌粟殼。

3.3 調味食品原料中生物毒素的檢測

調味食品原料中天然存在的毒素以及一些毒素的次級代謝產物，比如含有生物毒素的豆類或水稻等被加工成調味食品后，嚴重影響人體健康。為了更加安全、快捷、方便、有效地檢測調味食品原料中的生物毒素，建立了化學發光免疫分析檢測。米酒的釀造過程中，霉變水稻中生物毒素的檢測至關重要。2013年，Yu等[18]建立了黃曲霉毒素B1的化學發光酶免疫分析方法，該方法線性范圍為0.003～0.03 ng/mL，檢測限為0.0015 ng/mL，對水稻和綠豆的添加回收率分別為90%～104%和102%～117%。2015年，Kim等[19]基于化學發光免疫分析方法，建立了水稻中赭曲霉素A的檢測方法，檢測效果比酶聯免疫分析方法高7.3倍。

為了更好地節省時間以及化學試劑，化學發光免疫分析方法可實現多種生物毒素的同時檢測，傳統的酶聯免疫檢測暫時是無法實現的。2016年，Wang等[20]基于硅膠-水凝膠光子晶體微球技術，建立了黃曲霉毒素B1、伏馬菌素B2和赭曲霉毒素A多重真菌毒素的化學發光酶免疫分析檢測方法，3種毒素的線性檢測范圍分別為0.0001～1，0.001～10，0.0001～1 ng/mL，在水稻、玉米和小麥中的回收率分別為(74.96±5.82)%～(104.87±5.77)%。

3.4 調味食品原料中病原微生物檢測

病原微生物的存在可以引起調味食品原料的霉變和腐敗，進而對人體的健康產生影響，現階段檢測病原微生物的方法存在檢測周期長、方法繁瑣、需要大量的手工操作等不足，而化學發光免疫分析方法可以起到對以上不足之處的彌補。目前，基于化學發光免疫分析方法, 實現了對大腸桿菌的檢測,檢測結果均表現出較高的準確度和檢測靈敏度, 可顯著降低檢測時間, 因此，化學發光免疫分析方法在調味食品原料病原微生物檢測領域存在必然的發展趨勢。2008年，Wolter等[21]利用化學發光免疫分析方法，建立了水樣中大腸桿菌O157：H7、鼠傷寒沙門氏菌和嗜肺軍團菌的免疫檢測，這3種菌的檢測限分別為3×103,3×106，1×105個/mL。2006年，郭小英等[22]基于化學發光磁酶免疫法建立了大腸桿菌的檢測方法，與人工計數培養檢測相比，相關系數達到0.9807,這對于調味食品原料中大腸桿菌污染的快速檢測是非常有必要的。

4 展望

近年來，食品安全事件不斷出現，而調味食品又是日常生活中不能缺少的，調味食品安全問題也越來越受到人們的關注。因此，建立統一的調味食品原料安全檢測體系，對于調味食品原料快速統一的檢測方法和完善的質量控制措施是當務之急的工作。

由于化學發光免疫分析較強的檢測專一性、較高的靈敏度、儀器使用和操作相對簡單、可同時進行多重檢測等優點,在調味食品原料安全檢測方面得到了良好的應用。目前對于該方法的應用主要還是在抗原、抗體和半抗原的免疫測定中,這勢必在調味食品原料安全檢測領域中提供一種超痕量的免疫檢測手段?？傮w而言，與傳統的酶聯免疫分析方法相比，該方法檢測靈敏度更高，對于分子量較小的化合物也能進行檢測，并且可以實現多種有害物質的殘留檢測，而傳統的酶聯免疫分析在進行多種成分檢測時較困難。但是，金茂俊等發現目前的化學標記物發光值尚不十分穩定，從而造成批內批間的變異系數會高于酶聯免疫分析方法[23]。所以，化學發光免疫分析依然存在一些在試驗中亟待解決的困擾，比如(1)尋找更多更加穩定的化學發光標記物；(2)對目前使用較多的標記物質穩定性的改進和改造；(3)探索與其他新型技術聯合應用，實現多組分同時快速有效的檢測，節約時間成本；(4)如何提高電化學發光檢測的應用穩定性。隨著科技的不斷發展，相信在不久的將來化學發光免疫分析方法一定能在調味食品原料安全檢測中不斷展現其優越性。

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