微生物源食品防腐劑在調味品中的應用

孫啟星，侯杰，周其洋，童星*

(1.佛山市海天調味食品股份有限公司，廣東 佛山 528000；2.佛山市海天(高明)調味食品有限公司，廣東 佛山 528500)

釀造調味品含有豐富的蛋白質、氨基酸、糖和維生素等營養(yǎng)物質，容易引起微生物的生長繁殖，使食品發(fā)生變質。在食品生產(chǎn)過程中，通常添加食品防腐劑殺菌或抑菌來保持食品品質。目前在調味品行業(yè)中，常用的防腐劑主要為化學防腐劑，如苯甲酸鈉、山梨酸鉀等。隨著人們生活水平的日益提高，越來越多的消費者追求綠色食品，并且更加強調天然防腐劑的使用，因而探索天然產(chǎn)物作為食品防腐劑已成為研究熱點[1]。天然防腐劑是指從天然生物中提取的具有抑制微生物生長和保護產(chǎn)品的功能性物質，根據(jù)其來源不同，分為微生物源防腐劑、植物源防腐劑和動物源防腐劑，其具有化學合成防腐劑無法比擬的優(yōu)點，如：抗菌性強、安全性高、熱穩(wěn)定性好、作用范圍廣等[2]。微生物源防腐 劑是指微生物本身或其代謝產(chǎn)物具有抑菌防腐的功效，是一種安全無毒、天然高效的食品防腐劑，可通過微生物培養(yǎng)過程進行工業(yè)化生產(chǎn)[3]。本文主要介紹了3種常見的微生物源食品防腐劑的理化性質、抑菌機制、抑菌性以及在調味品中的應用研究，旨在為開發(fā)高效、安全的天然防腐劑應用于調味品行業(yè)的研究提供參考。

1 乳酸鏈球菌素

1.1 理化性質

乳酸鏈球菌素(Nisin)是由34個氨基酸組成組成的多肽抗菌素類物質，分子量為3150 Da，其活性體為二聚體或四聚體[4]。Nisin作為一種白色易流動的粉末，其穩(wěn)定性和溶解性都與溶液pH值密切相關，在中性和堿性條件下幾乎不溶解，食品加工應用時要先用酸性溶液溶解。在pH 6.5條件下，85 ℃加熱15 min，活性損失40%，而在pH 2.0鹽酸中，121 ℃高溫滅菌仍保持活性。Nisin對人體無毒害作用，易被消化水解為氨基酸，并且不改變腸道內正常菌落，是一種安全的防腐劑。

1.2 抑菌機制

Nisin的抑菌機理還沒有明確的定論，目前已研究成果表明，Nisin是帶正電荷、疏水性的多肽物質，能結合于細胞壁上帶負電荷的磷壁酸、酸性多糖或磷脂分子上，抑制細胞壁主要成分合成或與細胞膜形成孔道復合物，消耗ATP，改變細胞膜結構，從而終止細胞的一系列能源反應，使細胞內ATP、離子等流出，導致細胞膜內外能差消失，引起細胞死亡或消融[5]。Breukink E等[6]研究表明Nisin主要依賴于肽聚糖分子作用在細胞膜上，形成空洞，造成內容物的泄露，導致細胞自溶死亡。Zhao Xingchen等[7]通過基因表達方式分析，Nisin是通過阻礙金黃色葡萄球菌中主要功能性基團的轉錄而起到抑菌作用，對其抑菌機理進行了微觀研究。Nisin對芽孢的作用是在芽孢萌發(fā)前期破壞膜結構，抑制其發(fā)芽而非殺死芽孢。

1.3 抑菌特性

乳酸鏈球菌素能有效地殺死或抑制食品腐敗變質的革蘭氏陽性菌，如產(chǎn)芽孢桿菌、耐熱腐敗菌、葡萄球菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等，根據(jù)這一特性它被廣泛地應用在經(jīng)熱處理的包裝食品中作為防腐劑。Nisin對革蘭氏陰性菌、酵母和霉菌沒有抑制作用，但是與其他防腐劑復配使用能增強其抑菌作用，擴大抑菌范圍。利用Nisin不抑制酵母菌的特性，可被用于啤酒、果酒等酒精飲料中，防止乳酸菌引起的酸敗。賀松等[8]證明Nisin對乳品工業(yè)常用的乳酸菌具有較強的抑菌作用，抑菌效果持久，可達30～48 h。近年來也有研究表明，在一定條件下，如冷凍、加熱、低pH等，Nisin可以抑制一些革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、沙門氏菌等。Khan等[9]研究表明，在pH 5～6條件下，當一定濃度的Nisin與EDTA結合時，可以抑制大腸桿菌、李斯特氏菌的生長。

1.4 在調味品中的應用

作為一種天然防腐劑，Nisin已經(jīng)被廣泛應用在乳制品、肉制品、罐頭食品、啤酒和果汁飲料中，在調味品中的應用研究也有報道。在調味品中應用，Nisin的主要功效為：(1)建立復配型防腐劑，發(fā)揮多種防腐劑的互補增效作用，增強抑菌效果，延長食品保質期，如姜元榮等[10]將Nisin和納他霉素復配應用于醬油防腐，可降低MIC至8 μg/kg，有效抑制醬油的霉變，延長貨架期保存時間；(2)降低滅菌溫度，縮短熱處理時間，降低高溫對食品營養(yǎng)和感官的影響，如李增利等[11]研究表明Nisin可代替化學防腐劑用于醬油的防腐保鮮，減輕醬油的巴氏滅菌強度，保持醬油原有營養(yǎng)成分、風味、色澤，延長貨架期；(3)酸性熱穩(wěn)定，對食品色、香、味、口感無影響。

除了在成品中添加Nisin抑制微生物生長外，也可在發(fā)酵過程中加入，這優(yōu)于化學防腐劑的特性。如在白酒發(fā)酵過程中加入Nisin，可有效降低白酒總酸，抑制白酒發(fā)酵中乳酸菌的生長繁殖，控制白酒醪液中乳酸、乳酸乙酯的生成，提高白酒品質[12]；而醬油等調味品由多菌種天然釀造而成，發(fā)酵過程中添加Nisin也可抑制特定菌種或雜菌對品質的影響。

在其他調味品應用上，Nisin主要是與其他防腐劑進行復配使用，而非單一添加應用，因此后續(xù)在開發(fā)Nisin防腐效果上，應采用復配型防腐劑。

2 聚賴氨酸

2.1 理化性質

ε-聚賴氨酸(ε-PL)是由放線菌通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)的一種同型氨基酸聚合物，是一種次級代謝產(chǎn)物，其由L-賴氨酸的ε-NH2和α-COOH縮合而成，分子量約為3500 Da[13]。ε-PL多以鹽酸鹽形式存在，其成品為淡黃色粉末，在水中溶解度較大，但是難溶于有機溶劑。ε-PL水溶液略有苦味，無其他不良口感；熱穩(wěn)定性好，在高溫加熱條件下，如120 ℃加熱處理20 min，均保持抑菌能力。不同聚合度ε-PL具有不同的抑菌活性，目前研究表明當ε-PL聚合度為28～35時，其抑菌活性最好，當聚合度低于10時，則失去抑菌活性[14]。ε-聚賴氨酸是由L-賴氨酸聚合而成，進入人體后，能夠很快被人體消化分解為賴氨酸，而賴氨酸是食品中需要強化的氨基酸，同時也是人體必需的8種氨基酸之一，因此聚賴氨酸是一種非常安全的微生物抑菌劑，并且能夠提供給人體營養(yǎng)。

2.2 抑菌機制

目前已有研究表明，ε-PL是通過靜電吸附作用結合于細胞表面，然后通過一系列的反應使細胞死亡或自溶。ε-PL的作用方式主要是改變細胞膜的結構，進而改變細胞形態(tài)，使磷脂雙分子層彎曲或形成囊泡等，使細胞膜功能紊亂，阻止胞內外的物質交流和轉換或抑制RAN轉錄等，從而導致細胞自溶或者死亡。Ye等[15]研究表明，當以ε-PL處理E.coliO157∶H7時，ε-PL首先與細胞膜相結合，從而改變細胞膜的流動性和完整性，阻礙細胞膜內基因的轉錄表達，同時誘導ROS產(chǎn)生氧化壓力和SOS反應，使細胞發(fā)生自溶。Hyldgaard等[16]研究進一步發(fā)現(xiàn)，ε-PL不僅能夠與細胞膜相結合，還能夠進入細胞內部，直接影響細胞內蛋白質的合成，或影響細胞呼吸作用，改變其代謝功能，從細胞內部誘導細胞凋亡。

2.3 抑菌特性

ε-PL的抑菌譜較廣，對絕大部分微生物均具有抑菌作用，其中對革蘭氏陽性和陰性菌、細菌、霉菌的抑制效果最強，在100 μg/mL以下就能達到較好的抑菌效果，對其他微生物抑菌作用根據(jù)不同體系抑菌強弱不同。Delihas等[17]研究表明，ε-PL對各種細菌都具有抑菌作用，其中分期桿菌抑菌效果最強，其他細菌抑菌效果稍弱，但是都能達到良好的殺菌作用。ε-PL對微生物孢子也具有顯著抑制作用，如Hiraki等[18]以B.coagulans,B.stearothermophilus和B.subtilis3種芽孢桿菌作為研究對象，研究結果表明：ε-PL能夠有效抑制孢子的萌發(fā)，其抑制濃度分別為12.5，2.5，12.5 μg/mL。在堿性條件下，ε-PL抑菌活性大幅下降，這是因為ε-PL等電點在9.0左右，不能通過靜電吸附作用在微生物上，進而引起殺菌作用，而在中性和微酸性環(huán)境中具有極強抑菌活性。ε-PL熱穩(wěn)定性較好，Hu Y T等[19]發(fā)現(xiàn)ε-PL經(jīng)高溫處理后，不僅能夠保持抗菌性，還有很強的乳化特性，不受高濃度食鹽影響。此外，還具有水溶性好，不影響食品風味等優(yōu)點。

2.4 在調味品中的應用

我國于2014年批準聚賴氨酸作為食品防腐劑在食品中使用，目前其在調味品中的應用研究較少。由于ε-PL具有廣譜抑菌性特點，在調味品中可單獨添加應用，如在醬腌菜中，單獨添加聚賴氨酸60 μg/mL時，可以完全抑制腐敗細菌Bacillussubtilis和Bacillusthurinqiensis生長，抑菌效果優(yōu)于化學防腐劑(苯甲酸鈉和山梨酸鉀)；在醬油加工的調味雞飯的調味液中添加0.12%的ε-PL，浸漬雞肉后，在30 ℃保存也能大大抑制酵母菌等增值，延長保存期。

為進一步提高抑菌活性，降低使用量，擴大抑菌譜等，ε-PL通常與其他防腐劑復配使用，協(xié)同抑菌。程濤等[20]研究表明聚賴氨酸在食醋中的最佳用量為60 mg/kg，并且聚賴氨酸與EDTA、山梨酸鉀作為復合防腐劑時，抑菌率達96%以上，能有效延長食醋保質期。

添加ε-PL除了具有防腐作用外，還有利于保持產(chǎn)品色澤。秦蕓樺等[21]采用ε-PL對鮮切竹筍進行處理，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理過的鮮切竹筍L值和a值均高于對照，有利于保持竹筍色澤。

在其他食品如米飯、面條、湯類和熟蔬菜中，聚賴氨酸被廣泛應用，如張春紅等[22]研究表明，添加ε-PL濕面條保鮮時間比化學防腐劑延長了20%，并且使用價格低于化學防腐劑；在冷鮮肉保藏上，李迎秋將牛肉經(jīng)過ε-PL處理后，不僅能夠有效抑制微生物的生長，還能保持牛肉的色澤，減少蛋白質的損失，其最佳處理濃度為1.25%。因此，ε-PL被廣泛應用于各種食品中，其在調味品中也具有廣泛的應用前景和巨大的市場價值。

3 納他霉素

3.1 理化性質

納他霉素是一種多烯大環(huán)內脂類抗菌劑，外觀呈白色或奶油色，為無味結晶粉末，相對分子量為665.75。納他霉素是一種兩性物質，分子中含有酸性、堿性兩種基團，等電點為pH 6.5。其微溶于水和有機溶劑中，難溶于大部分非極性有機溶劑，室溫下水中的溶解度為30～100 mg/L。在pH 4.5～9之間非常穩(wěn)定，在極端pH條件下會迅速失活，但是對其抗真菌活性沒有明顯影響。熱穩(wěn)定性好，121 ℃加熱30 min，活性幾乎無損失，但是對紫外線敏感，不宜與光接觸。一些氧化劑(過氧化氫、漂白粉)和重金屬(鐵、鉛、汞等)也會影響納他霉素的活性。

3.2 抑菌機制

納他霉素的抑菌機理主要是通過納他霉素的疏水性部分與細胞膜表面的甾醇類化合物相結合，主要以范德華力作為引力，形成一種復合物(抗生素-甾醇復合物)。這種復合物的形成能夠改變細胞質的通透性，導致細胞內營養(yǎng)物質、ATP、氨基酸、蛋白質等重要物質滲漏，或引起胞內一系列化學反應，進而使細胞死亡。Vimr通過等溫滴定比色法和直接結合法的研究顯示，納他霉素可專一性地與細胞膜中的麥角固醇結合，與小囊泡形成顯著的相互作用，而不與不含甾醇的小囊泡發(fā)生相互作用[23]。另外也有研究表明，納他霉素特異性地結合甾醇后，并沒有改變細胞膜的通透性，而是以一種未知的機制來抑制真菌的生長[24]。納他霉素的抑菌機制與麥角固醇存在密切關系，因此，那他霉素的抑菌活性主要取決于微生物的細胞壁或細胞上是否存在類似固醇化合物，這是其抗菌的關鍵基礎。

3.3 抑菌特性

納他霉素對幾乎所有的霉菌和酵母菌都具有抗性，但是對細菌和病毒無效。在抑菌效果上，納他霉素抑菌作用比山梨酸鉀強100～200倍，如大部分霉菌在納他霉素0.5 μg/mL以下時被完全抑制，而酵母菌需要在5 μg/mL濃度才會被抑制。孫啟華等[25]通過試管稀釋法和瓊脂稀釋法對納他霉素的抑菌效果研究表明，納他霉素對所試黃曲霉菌、青霉菌和酵母菌具有較強的抑制作用。Erich等[26]研究表明，經(jīng)過人為誘導，真菌對納他霉素幾乎不形成抗性，這主要是由于納他霉素對真菌具有較強抑菌活性。由于納他霉素對細菌不起作用，可直接加到酸奶等發(fā)酵品中，從而抑制產(chǎn)品中霉菌、酵母菌等有害真菌的繁殖。此外，Ray報道納他霉素能減少黃曲霉中的黃曲毒素、赭曲霉中的赭曲霉素和青霉菌中的青霉素的產(chǎn)生，減少真菌毒素對人類造成的危害[27]。

3.4 在調味品中的應用

納他霉素是一種抗真菌制劑，對霉菌和酵母菌具有極強的抑制作用，因此在醬油、食醋等調味品中單獨添加納他霉素，可防止霉菌和酵母菌引起的變質。陸曉濱等[28]研究了納他霉素在醬油中的應用，當納他霉素添加量為15 mg/kg時，能夠有效抑制醬油中耐鹽性酵母菌的生長繁殖，防止白花的出現(xiàn)，且納他霉素使用成本低，對醬油的品質和風味無影響[29]。同時，在蠔油中添加納他霉素，可以有效抑制蠔油的霉變，延長保質期達4周以上。姚勇芳等[30]研究表明納他霉素在醬油中應用效果良好，能有效抑制霉菌生長，提高產(chǎn)品貨架期。

調味品應用具有使用頻繁、常溫儲存、易暴露空氣等特點，易感染除真菌外的細菌等雜菌，因此實際應用上納他霉素不能作為單一防腐劑使用，需與其他防腐劑協(xié)同作用。丁培峰等[31]研究表明，在醬油中添加任何一種天然防腐劑(納他霉素、乳酸鏈球菌素、茶多酚)，只能起到部分抑菌作用，不能達到醬油保鮮效果，將天然防腐劑復配后，利用各自抑菌互補的特性，能夠抑制貨架期內微生物的增殖。其他研究也表明，納他霉素和茶多酚復配后使用防腐效果優(yōu)于山梨酸鉀化學防腐劑，并可提高醬油的營養(yǎng)價值和保健功能[32]。

納他霉素也可在發(fā)酵過程中添加，抑制雜菌生長，促進優(yōu)勢菌群生長繁殖。韓德權[33]將納他霉素應用于酸菜發(fā)酵過程中，酵母菌、霉菌等雜菌的生長被抑制，而乳酸菌生長不受影響，使產(chǎn)品香氣明顯改善，酸菜的感官品質明顯提高。

此外，在檢測方法上，劉超等[34]通過高效液相色譜-串聯(lián)質譜方法能夠準確、高效地檢測出醬油中納他霉素含量，該方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡單等特點。

4 展望

近年來，隨著消費者對綠色添加劑的關注，天然防腐劑代替化學防腐劑是調味品行業(yè)未來發(fā)展的趨勢。目前，天然防腐劑在食品行業(yè)已經(jīng)逐漸投入實際應用，本文所述的3種微生物源防腐劑被美國、日本、韓國等國家廣泛應用在食品防腐上，除了改善食品的保質期和安全性外，也有利于保持食品品質營養(yǎng)和開發(fā)新產(chǎn)品。國內在生物防腐劑上的研究起步較晚，雖然已應用在不同食品上，但是在調味品上的實際應用還未見報道。這主要是由于生物防腐劑的大規(guī)模推廣應用還存在許多問題，如在實際食品體系中生物防腐劑的抑菌水平、單一防腐劑應用的局限性等。通過加深生物防腐劑的研發(fā)和應用，根據(jù)不同產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝、配方和貯藏環(huán)境等不同，開發(fā)出不同復合型生物防腐劑，并且精確評估其抑菌作用，保證消費者的健康飲食。

除了本文所陳述的3種常見微生物源食品防腐劑外，越來越多的天然防腐劑被開發(fā)應用，如紅曲、殼聚糖、抗菌肽等。隨著對抗菌物質分子結構、抑菌機理和抑菌性的不斷深入研究，高效、安全、廉價的食品防腐劑將被逐漸應用，大大提高行業(yè)品質。

綜上所述，微生物源食品防腐劑將會得到廣泛應用，促進調味品行業(yè)產(chǎn)業(yè)升級。