水蛭的化學成分研究*

李國強，李韻儀，李 桃，李藥蘭，王國才，王春華，李 正

（1.佛山科學技術學院，食品科學與工程學院，佛山 528000；2.暨南大學藥學院，廣州 510632；3.天津中醫藥大學中藥制藥工程學院，天津 300193）

中藥水蛭為水蛭科動物螞蟥（Whitmania pigra）的干燥全體，具有破血通經、逐瘀消癥的功效，主治血瘀經閉、癥瘕痞塊、中風偏癱以及跌打損傷等癥[1]。水蛭的炮制方法《傷寒論》中有所記載，大致有凈制、切、加輔料和不加輔料制幾大類，十幾種炮制方法。現代對水蛭的炮制大多采用酒制、滑石粉燙、砂燙等方法。水蛭的主要成分為大分子類化合物，主含蛋白質，含有17種氨基酸，水解氨基酸含量高達49.4%，包括人體必須的8種氨基酸[2]；還含有如水蛭素、肝素、組織胺、吻蛭素、氨基酸等；水蛭中也含有糖脂類、蝶啶類、甾體類和羧酸酯類等多種小分子類物質；此外微量元素主要含有Zn、Mn、Fe、Co、Cr、Se、Mo、Ni等 14 種微量元素。水蛭具有抗細胞凋亡、抗腫瘤、抗凝、抗血栓、抗炎、抗纖維化等藥理作用[3-7]。隨著水蛭的人工培養和環境的變化，水蛭的化學成分研究一直是科研工作者的研究熱點和難點。所以，為進一步充分利用和開發中藥水蛭，豐富水蛭藥材的化學成分組成，為水蛭的藥效學研究提供科研數據，本實驗對中藥水蛭的化學成分進行了系統研究，從中分離并鑒定了9個化合物，分別為:吲哚-3-甲酸-β-D-吡喃葡萄糖苷（1）、3-吲哚-甲醛（2）、腺苷（3）、2-羥基嘌呤核苷（4）、尿嘧啶核苷（5）、腺嘌呤（6）、尿嘧啶（7）、黃嘌呤（8）和 2-哌啶酮（9）。所有化合物均為首次從該藥材中分離得到。

1 儀器與材料

Bruker AV-300 MHz核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司）;Agilent 6210 LC/MSD TOF質譜儀（美國Agilent公司）;Agilent-1260分析型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;Agilent-1260制備型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；薄層層析用硅膠GF254薄層預制板（煙臺化學工業研究所）；柱色譜用硅膠（青島海洋化工廠），Sephadex LH-20（Pharmacia公司），ODS柱層析材料（德國Merck公司）；高效液相色譜及質譜儀分析使用試劑為色譜純，其他試劑均為分析純。

水蛭藥材于2011年3月購于廣東省清平藥材市場，由暨南大學藥學院周光雄教授鑒定為水蛭科螞蟥的干燥全體。藥材標本（編號20110325）保存于暨南大學中藥及天然藥物研究所。

2 提取與分離

干燥的水蛭全體4 kg粉碎后用95%乙醇在80℃下回流提取3次，合并提取液，減壓回收溶劑，得到總浸膏460 g，將總浸膏用適量水混懸后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到相應部位的萃取物。乙酸乙酯萃取物（40 g）經硅膠柱層析，氯仿/甲醇（100∶0-1∶1）梯度洗脫，經 TLC 分析合并，得到9個餾分（Fr.1-6）。餾分Fr.2（3.2 g）進一步經硅膠柱層析分離及Sephadex LH-20凝膠柱（氯仿-甲醇）分離純化得到化合物 1（9.3 mg）、2（5.3 mg）。餾分Fr.3（9.7 g）經 ODS 柱層析，甲醇/水（40∶60-100∶0）梯度洗脫，TLC檢測，得到4個餾分Fr.3.1～Fr.3.4。Fr.3.2經Sephadex LH-20凝膠柱分離純化得到化合物 3（6.3 mg）、4（7.2 mg）。Fr.3.3（300 mg）經高效液相色譜制備，以甲醇/水（60∶40）為流動相，分離純化得到化合物 5（6.5 mg）、6（5.9 mg）、7（8.1mg）。餾分 Fr.5（3.7 g）經 ODS 柱層析，甲醇/水（40∶60-100∶0）梯度洗脫及 Sephadex LH-20凝膠柱（氯仿-甲醇）分離純化得到化合物 8（6.6 mg）、9（5.9 mg）。

3 結構鑒定

化合物 1：淡黃色油狀物。UV（MeOH）λmax:212、228、282 nm。ESI-MSm/z 346[M+Na]+,分子式為C15H17NO7;1H-NMR （300 MHz,CD3OD）δ:8.10（1H,m,H-4）,8.07（1H,s,H-2）,7.46（1H,m,H-7）,7.22（1H,m,H-6）,7.20（1H,m,H-5）,5.74（1H,d,J=7.9,H-1′）,3.88 （1H,dd,J=12.1,1.9 Hz,H-6′a）,3.72（1H,dd,J=12.1,4.6 Hz,H-6′b）,3.54（1H,m,H-2′）,3.53（1H,m,H-3′）,3.47（1H,m,H-5′）,3.44（1H,m,H-4′）；13C-NMR （75 MHz，CD3OD）δ:134.4 （C-2）,107.7（C-3）,122.1（C-4）,122.9（C-5）,124.1（C-6）,113.2（C-7）,138.4（C-8）,127.6（C-9）,165.8（C-10）,95.5（C-1′）,78.9（C-2′）,78.4（C-3′）,74.3（C-4′）,71.3（C-5′）,62.6（C-6′）。以上數據與文獻[8]報道對照基本一致，故鑒定化合物1為吲哚-3-甲酸-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物 2：淡黃色粉末。UV（MeOH）λmax:208、242、258、296 nm。ESI-MSm/z146[M+H]+,分子式為C9H7NO;1H-NMR（300 MHz,D2O）δ:7.64（1H,m,H-5）,7.51（1H,m,H-8）,7.27（1H,m,H-2）,7.21（1H,m,H-7）,4.09（1H,m,H-1）,3.57（1H,dd,J=10.4,4.6 Hz,H-3）,3.15（1H,m,H-4a）,2.81（1H,m,H-4b）；13C-NMR（75 MHz,D2O）δ:139.9（C-2）,120.3（C-3）,125.2（C-4）,122.5（C-5）,123.8（C-6）,113.3（C-7）,139.1（C-8）,125.9（C-9）,187.6（C-10）。以上數據與文獻[9-10]報道對照基本一致，故鑒定化合物2為3-吲哚-甲醛。

化合物 3：白色粉末。UV（MeOH）λmax:206、220、268 nm。ESI-MS m/z 268 [M+H]+,分子式為C10H13N5O4;1H-NMR （300 MHz,CD3OD）δ:8.34（1H,s,H-8）,8.13（1H,s,H-2）,7.33（2H,s,NH2-6）,5.87（1H,d,J=6.2 Hz,H-1′）,5.48 （1H,m,OH-2′）,5.42（1H,m,OH-5′）,5.23（1H,m,OH-3′）,4.60（1H,m,2′）,4.14（1H,m,3′）,3.96（1H,m,4′a）,3.67（1H,m,5′a）,3.55（1H,m,5′b）；13C-NMR（75 MHz,CD3OD）δ:152.4（C-2）,149.0（C-4）,119.3（C-5）,156.1（C-6）,139.9（C-8）,87.9（C-1′）,73.4（C-2′）,70.6（C-3′）,85.9（C-4′）,60.7（C-5′）。以上數據與文獻[11]報道對照基本一致，故鑒定化合物3為腺苷。

化合物4：白色粉末。UV（MeOH）λmax:206、248nm。ESI-MSm/z291[M+Na]+,分子式為C10H12N4O5;1H-NMR（300 MHz,CD3OD）δ:8.29（1H,s,H-8）,8.18（1H,s,H-6）,6.06（1H,d,J=5.8 Hz,H-1′）,4.77（1H,dd,J=5.8,5.2 Hz,H-2′），4.43 （1H,dd,J=5.2,3.8 Hz,H-3′）,4.28（1H,m,H-4′）,3.93（1H,dd,J=12.8,2.9 Hz,H-5′a）,3.80 （1H,dd,J=12.8,3.9 Hz,H-5′b）；13CNMR（75 MHz,CD3OD）δ:160.2（C-2）,148.5（C-4）,124.1（C-5）,147.4（C-6）,139.9（C-8）,88.3（C-1′）,70.4（C-2′）,73.9（C-3′）,85.5（C-4′）,61.3（C-5′）。以上數據與文獻[12]報道對照基本一致，故鑒定化合物4為2-羥基嘌呤核苷。

化合物5：白色粉末。UV（MeOH）λmax:208、262nm。ESI-MSm/z267[M+Na]+，分子式為C9H12N2O6;1H-NMR（300 MHz,CD3OD）δ:7.86（1H,d,J=8.1 Hz,H-6）,5.89（1H,d,J=5.4 Hz,H-1′）,5.87（1H,d,J=8.1,H-5）,4.34（1H,dd,J=5.4,4.6 Hz,H-2′）,4.22（1H,t,J=5.4，5.4 Hz,H-3′）,4.12 （1H,m,H-4′）,3.91（1H,dd,J=12.8,2.9 Hz,H-5′a）,3.80（1H,dd,J=12.8,4.3 Hz,H-5′b）；13C-NMR（75 MHz,CD3OD）δ:154.7（C-2）,166.3（C-4）,102.2（C-5）,141.7（C-6）,89.3（C-1′）,73.6（C-2′）,69.3（C-3′）,84.1（C-4′）,60.7（C-5′）。以上數據與文獻[13]報道對照基本一致，故鑒定化合物5為尿嘧啶核苷。

化合物6：白色粉末。UV（MeOH）λmax:206、260nm。ESI-MSm/z 136[M+H]+,分子式為C5H5N5;1H-NMR（300 MHz,D2O）δ:7.99（1H,s,H-2）,7.92（1H,s,H-8）；13C-NMR（75 MHz,D2O）δ:154.0（C-2）,150.4（C-4）,118.1（C-5）,155.2（C-6）,147.4（C-8）。以上數據與文獻[14]報道對照基本一致，故鑒定化合物6為腺嘌呤。

化合物 7：白色粉末。UV（MeOH）λmax:206、258 nm。1H-NMR （300 MHz,DMSO-d6）δ:11.00（1H,s,H-3）,10.80（1H,s,H-1）,7.38（1H,d,J=6.9 Hz,H-6）,5.45（1H,d,J=6.9Hz,H-5）；13C-NMR（75 MHz,DMSO-d6）δ:151.6（C-2）,164.4（C-4）,100.3（C-5）,142.2（C-6）。以上數據與文獻[15]報道對照基本一致，故鑒定化合物7為尿嘧啶。

化合物 8：淡黃色粉末。UV（MeOH）λmax:204、262 nm。ESI-MS m/z 151 [M-H]+,分子式為C5H4N4O2;1H-NMR（300 MHz,DMSO-d6）δ:7.82（1H,s,H-8）;13C-NMR（75 MHz,DMSO-d6）δ:151.8（C-2）,149.4（C-4）,107.9（C-5）,156.0（C-6）,140.8（C-8）。以上數據與文獻[16]報道對照基本一致，故鑒定化合物8為黃嘌呤。

化合物 9：淡黃色油狀物。UV（MeOH）λmax：206 nm。ESI-MSm/z100[M+H]+,分子式為C5H9NO;1H-NMR（300 MHz,CD3OD）δ:3.27（2H,m,H-6）,2.30（2H,m,H-3）,1.79（2H,m,H-4）,1.76（2H,m,H-5）；13C-NMR （75 MHz,CD3OD）δ:175.1 （C-2）,32.1（C-3）,21.8（C-4）,23.2（C-5）,43.1（C-6）。以上數據與文獻[17]報道對照基本一致，故鑒定化合物9為2-哌啶酮。