蘿卜硫素通過Traf6/TAK1信號通路介導人胃癌細胞凋亡的機制研究

朱 濤，王永翠

（1.恩施土家族苗族自治州中心醫院消化內科，恩施 445000；2.恩施州婦幼保健計劃生育服務中心，恩施 445000）

胃癌是比較常見的消化道惡性腫瘤，在全球惡性腫瘤發病率中居前列，而且其病死率也較高，位于腫瘤致死率的第2位。調查發現，由于食品安全及環境生化毒性物質的累積，消化道腫瘤的發病率呈逐年上升的趨勢。胃癌的早期診斷率較低，而且是一種多因素導致、致病機制復雜的腫瘤，在胃癌研究與診治方面仍然需要大量研究[1-3]。蘿卜硫素主要提取于十字花科蔬菜中的一種異硫氰酸酯類活性物質，包括西蘭花、花椰菜及甘藍菜等[4]。近年來較多的研究發現蘿卜硫素可以預防、延緩及逆轉腫瘤發生之前的病理改變，并且對多種腫瘤表現出較好的藥理作用[5-8]，也許會成為臨床上常用的抗腫瘤藥物。早期報道腫瘤壞死因子受體相關分子6（Traf6）/轉化生長因子-β活化激酶1（TAK1）信號通路的活化在細胞凋亡中起著重要的作用，Traf6作為一種銜接蛋白可以介導LTR4信號的傳導，最終激活核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路，誘導細胞凋亡的發生[9-10]。賀云沖等[11]研究發現蘿卜硫素可以抑制胃癌細胞的生長和侵襲，抑制炎癥因子的表達，也許是胃癌輔助治療的新途徑，但對其作用機制目前尚不清楚。因此，本實驗研究Traf6/TAK1信號通路在蘿卜硫素誘導胃癌細胞（HGC27）凋亡中的作用。

1 材料及方法

1.1 藥品及試劑 蘿卜硫素（上海寶曼生物科技有限公司，批號：4478-93-7，純度≥99%）；DMEM培養基及0.25%胰酶（上海谷歌生物有限公司）；胎牛血清（美國 Gibco公司，批號：110524）；CCK8試劑盒（江蘇碧云天生物科技研究所，批號：WH1175）；Annexin-FITC細胞凋亡試劑盒（江蘇凱基生物有限公司，批號：KGA106）；BCA試劑盒（上海威奧生物科技有限公司，批號：WB0123）；SDS-PAGE試劑盒（武漢谷歌生物有限公司，批號：P1320）；兔抗人Traf6、TAK1、p-TAK1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）及β-actin等多克隆一抗（英國Abcam公司），HRP標記山羊抗兔IgG（武漢谷歌生物科技有限公司）。

1.2 細胞培養與藥物處理 人胃癌細胞株HGC27購自武漢巴菲爾生物有限公司，HGC27細胞用1640培養基進行培養，包含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素，然后置于37℃、5%CO2的恒濕培養箱中進行培養。待細胞生長至培養瓶底的90%左右時便可進行消化傳代培養。然后取對數生長期的細胞接種于96孔板或6孔板，待細胞貼壁后加入不同濃度的蘿卜硫素（15、30、60 mg/L）處理細胞，再進行后續實驗。

1.3 細胞活力檢測 取生長對數期細胞，0.25%Trypsin+0.02%EDTA 消化離心，計數后，以 1×104/孔細胞鋪96孔板，37℃、5%CO2的恒濕培養箱中孵育培養過夜。然后分別加藥（正常組、15、30、60 mg/L組），分別培養 24、48、72 h后，使用 CCK8試劑盒檢測細胞活力。獨立重復實驗4次。

1.4 細胞凋亡檢測 取生長對數期細胞，然后以1×105/孔細胞數接種于6孔板中，培養過夜后，吸盡舊培養基，然后加入含不同濃度蘿卜硫素（15、30、60 mg/L）的新鮮培養基繼續孵育處理24 h后，除去孔內培養基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞3次，加入不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶進行消化收集細胞，再用PBS清洗細胞3次，5 000 r/min離心6 min，收集細胞。然后將細胞重懸后加入5μL PI混勻，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測蛋白表達 取生長對數期細胞，然后以1×105/孔細胞數接種于6孔板中，培養過夜后，吸盡舊培養基，然后加入含不同濃度蘿卜硫素（15、30、60 mg/L）的新鮮培養基繼續孵育處理24 h后，收集細胞裂解，檢測蛋白濃度，然后每孔以50μg蛋白量上樣進行凝膠電泳分離，電壓設置為70 V；待分離完成后進行轉膜，電流設定為275 mA、時間為70 min。接著將膜放入5%脫脂奶粉中封閉1 h，孵育一抗過夜，用TBST洗膜3次后室溫條件孵育對應HRP標記二抗1 h，再次洗膜3次，ECL顯影后便可進行蛋白表達分析。

1.6 統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行統計分析，實驗數據用均數±標準差表示，細胞增殖抑制實驗采用重復測量方差分析，其他實驗結果組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HGC27細胞增殖抑制實驗結果 經不同劑量蘿卜硫素作用后的HGC27細胞，生長活性受到不同程度的抑制，見表1。以正常細胞為對照，低劑量蘿卜硫素對HGC27細胞的抑制率較低，差異有統計學意義（P＜0.05）。隨著藥物濃度和處理時間的增加，HGC27細胞的增殖抑制率明顯升高，相對于對照組而言差異均有統計學意義（P＜0.05），且細胞的增殖抑制率呈時間-濃度依賴性。

2.2 HGC27細胞凋亡率檢測結果 不同劑量的蘿卜硫素對HGC27細胞凋亡率的影響結果如圖1、表2所示。藥物處理細胞24 h后，與正常對照組相比，3種濃度藥物干預組中細胞的凋亡率顯著升高（P＜0.05）。正常細胞的凋亡率為（5.42±0.42）%，而低、中、高劑量蘿卜硫素組中細胞的凋亡率上升至（12.52±1.21）%、（21.46±2.14）%及（33.41±3.94）%。

表1 蘿卜硫素對HGC27細胞增殖的抑制作用Tab 1 The inhibitory effect of sulforaphane on the proliferation of HGC27 cells%

表1 蘿卜硫素對HGC27細胞增殖的抑制作用Tab 1 The inhibitory effect of sulforaphane on the proliferation of HGC27 cells%

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與15μg/mL蘿卜硫素組比較，#P＜0.05；與 30 μg/mL 蘿卜硫素組比較，△P＜0.05；與本組藥物作用24 h 比較，▲P＜0.05；與本組藥物作用 48 h 比較，◆P＜0.05。

?

圖1 蘿卜硫素對HGC27細胞凋亡的影響Fig.1 The effect of sulforaphane on the apoptosis of HGC27 cells

表2 蘿卜硫素對HGC27細胞凋亡率的影響（Tab.2 The effect of sulforaphane on the apoptosis rates ofHGC27 cells（%

表2 蘿卜硫素對HGC27細胞凋亡率的影響（Tab.2 The effect of sulforaphane on the apoptosis rates ofHGC27 cells（%

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與15μg/mL蘿卜硫素組比較，#P＜0.05；與 30 μg/mL 蘿卜硫素組比較，△P＜0.05。

?

2.3 HGC27細胞凋亡相關蛋白Caspase-3、Bax及Bcl-2表達水平檢測 采用Western Blot方法，以未加藥物處理細胞為對照，HGC27細胞經低、中、高劑量蘿卜硫素作用24 h后，凋亡相關蛋白發生不同程度的變化，如圖2。其中促凋亡蛋白Caspase-3和Bax表達隨著藥物濃度的升高而增強，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平則隨藥物劑量的升高而降低，他們與空白對照組相比差異均有統計學意義（P＜0.05），表現出濃度依賴性。

2.4 HGC27細胞Traf6/TAK1信號通路蛋白檢測結果 采用Western blot方法，以未加藥物處理細胞為對照，HGC27細胞經低、中、高劑量蘿卜硫素作用24 h后，Traf6/TAK1信號通路蛋白表達量發生不同程度的變化，如圖3。Traf6蛋白在蘿卜硫素的誘導下，其表達量隨著藥物濃度的升高而增強，說明蘿卜硫素可以促進Traf6表達；與此同時，TAK1的磷酸化水平也顯著升高，呈現出劑量依賴性，與正常對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。由此說明，蘿卜硫素可以通過活化Traf6/TAK1信號通路誘導細胞凋亡的發生。

圖2 蘿卜硫素對Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表達水平的影響Fig.2 The effect of sulforaphane on the expression of Caspase-3,Bax and Bcl-2 protein

圖3 蘿卜硫素對Traf6/TAK1信號通路的影響Fig.3 The effect of sulforaphane on the Traf6/TAK1 signaling pathway

3 討論

細胞凋亡是機體保證內環境平衡的自我調控機制[12]，細胞增殖與凋亡相互之間的穩定在多種腫瘤的發生發展中有著重要作用[13]，細胞凋亡是一種程序化、多基因調節的細胞死亡過程，這一過程在抗腫瘤的治療方面上已成為研究的主要方向。本實驗結果發現，蘿卜硫素在15～60μg/mL濃度范圍內，均可以表現出對胃癌HGC27細胞增殖的抑制作用，并且隨著藥物劑量及藥物作用時間的延長，細胞增殖抑制率也隨之顯著升高，呈現出一定濃度和時間依賴性。接著采用流式細胞儀對HGC27細胞凋亡的情況進行研究發現，細胞凋亡率隨著藥物劑量的升高而增加，表現出明顯的劑量依賴性。實驗結果說明蘿卜硫素可以抑制胃癌細胞的增殖，并促使其發生早期凋亡。

TAK1受多種因素的刺激可以介導胞外信號的傳導，轉化生長因子-β（TGF-β）、Toll樣受體（TLR）、CD4及B細胞受體等細胞因子介導的信號均可由TAK1的磷酸化發揮相應的生物學效應[14]。研究報道Traf6表達水平上升可促使TAK1的磷酸化，進而誘導細胞炎癥、凋亡及氧化應激損傷的發生[15]。并且Trfa6/TAK1通路可介導TLR4信號傳導激活NF-κB通路介導細胞凋亡的發生[9-10]。其中TAK1的磷酸化可以活化或者阻滯多條信號傳導，如Bcl-2/Bax、mTOR及Caspase-9等。其中Bcl-2/Bax通路蛋白在細胞凋亡發生過程中起著關鍵的作用，也是TAK1信號傳導的重要下游靶標[16]。Bcl-2家族包括抗凋亡相關蛋白（如Bcl-2）和促凋亡相關蛋白（如Bax）等，在細胞凋亡中起著關鍵作用，其中Bcl-2/Bax蛋白含量的平衡在細胞是否發生凋亡中起著決定性作用。本實驗結果也發現蘿卜硫素可以明顯誘導Traf6及p-TAK1水平，還抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，并誘導了促凋亡蛋白Caspase-3、Bax的表達。于是，蘿卜硫素可以活化Traf6/TAK1的信號傳導，使Bcl-2/Bax蛋白表達量出現失衡，活化凋亡信號，誘導胃癌細胞的凋亡。

綜上所述，蘿卜硫素能夠抑制人胃癌細胞的增殖，誘導其凋亡，其作用機制可能與活化Traf6/TAK1信號通路相關。