大鼠斷肢不同保存方法與肌肉生物學特性的實驗研究

閻曉麗，張巍，劉琳琳，張樹明

(中國人民解放軍火箭軍總醫院骨科，北京 100088)

肌肉組織局部缺血6～8 h內退化到不可逆轉的程度[1]，因此缺血時間在斷肢移植治療中是很重要的影響因素。長時間的局部缺血會導致不可逆的壞死從而引發更加復雜的狀況，比如肌肉萎縮和功能缺失。在斷肢局部缺血超過6 h后肢體損傷嚴重程度評分會增加一倍[2]，局部缺血超過8 h后會導致移植失敗。如何最大程度地維持離斷肢體功能以及盡可能延長離斷肢體保存時間是當前該領域的研究熱點[3]。盡管保存液對于腎、肝、心臟等器官保存和移植應用廣泛，但它們很少被用于保存斷肢。一些研究顯示用于活體器官保存的溶液在用于保存骨骼肌時也具有良好的效果[4-5]。這些研究通過觀察移植狀況、三磷酸腺苷水平、病理性退化率、被電流刺激的骨骼肌的收縮力量等來評估這些被保存的骨骼肌的活力[6]。我們評估了從大鼠上分離的股四頭肌在不同保存液中保存不同時間后的肌肉形態學改變。

選取6 h和24 h兩個保存時間，ETK、UW和LR保存液保存肌肉用于斷肢后原位移植，手術后8周分別檢測肌肉再生狀況(形態與功能)，包括生化指標、肌肉電生理以及HE染色和馬氏三色染色病理學變化，對其進行比較，以選擇更適合斷肢保存的溶液。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與分組 選用成年標準Wistar大鼠，雌雄不限，體重(250±50)g。斷肢后再植實驗中，大鼠隨機分為6組，每組4～8只：ETK液保存6 h組(ETK-6 h)，UW液保存6 h組(UW-6 h)，LR液保存6 h組(LR-6 h)；ETK液保存24 h組(ETK-24 h)，UW液保存24 h組(UW-24 h)，LR液保存24 h組(LR-24 h)。

1.2 保存液配置 三組不同保存液配方見表1。

表1 不同保存液配方比較

1.3 股四頭肌分離后保存 從Wistar大鼠中分離的股四頭肌被切割成直徑8 mm、高3 mm、重0.5 g的圓柱狀。為了研究保存液對肌肉形態的影響，來自Wistar大鼠的股四頭肌分別用ETK，UW溶液保存在 4℃各3 h、6 h、9 h、12 h或24 h，LR溶液用作對照組。

之后將其用10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋。用蘇木精和伊紅染色然后觀察切片(3 μm)。隨機選取股四頭肌中央部分的橫切面觀察高度壓縮化的肌纖維和半球形肌纖維的數量，以及出現間質水腫的部分占全部面積的比例(Leica CTR 6000)，并用圖像分析系統Image J進行處理，分析損壞的肌纖維百分比及間質水腫的出現情況。

1.4 保存液保存移植斷肢 用10%水合氯醛按4 mL/kg體質量進行腹腔注射，麻醉后的大鼠仰臥位，固定頭和四肢。打開股內側皮膚，切口3 cm左右，逐層分離肌肉至股骨裸露。切斷股骨并立即浸入裝有ETK液、UW液或者LR液的無菌塑料培養箱。為了評估保存液對斷肢是否有長期維持功能的作用，供體斷肢被保存在4℃中持續6 h或24 h，我們進行了原位移植[7]。

1.5 手術步驟 切斷股骨處，用18號針作為髓內棒固定移植物。在顯微鏡下操作，股骨動脈和血管用10-0尼龍線捆合，坐骨神經用10-0尼龍線縫合；肌肉和皮膚用4-0尼龍線縫合。操作結束后，不使用全身性抗凝血劑或抗生素，平均手術時間為60 min[8]。

1.6 生化指標檢測 斷肢在4℃保存液保存6 h或24 h后進行原位移植手術，術后60 min頸靜脈取血，用于檢測血清內肌酸磷酸激酶(creatine phosphokinase，CPK)，天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)，肌酸酐(creatinine，Cr)(試劑盒均購自Sigma，St.Louis，MO USA)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)，尿素氮(bloodurea nitrogen，BUN)及鉀(potassium，K)(試劑盒均購自南京建成)的含量水平。

1.7 電生理學分析 手術8周后使用丹麥美敦力公司Keypoint系統進行復合肌肉動作電位(compound muscle action potential，compound motor action potential，CMAP)記錄。麻醉狀態下，暴露移植側的坐骨神經，安放刺激電極置于坐骨神經縫合處10 mm處刺激坐骨神經(0.2 mA單向脈沖，1 Hz，脈沖持續時間1 ms)。將記錄電極貼近脛骨前肌記錄，記錄電極和刺激電極的距離標準為30 mm。記錄脛骨前肌的運動潛伏期和振幅[9]。

1.8 再植肢體肌肉的組織學分析 在電生理學分析結束后，取下脛骨前肌，稱量脛骨前肌。用10%福爾馬林固定肌肉，石蠟包埋。在蘇木精-伊紅染色及馬氏三色染色(用于鑒別纖維組織)之后檢查組織樣本。我們觀察了肌肉纖維的直徑和纖維化區域(馬氏三色染色后的藍色長膠狀區域)所占的百分比。視野內隨機選取橫切面內的一百個肌肉細胞進行測量。

2 結 果

2.1 組織學分析分離的肌肉 在LR組中的3 h后檢測到高水平的肌肉纖維損傷及間質水腫。在所有時間段內，ETK組中損傷的肌纖維百分比都低于LR組(P<0.05，見圖1)。更進一步，在3 h、6 h、12 h和24 h時，ETK和UW組中的間質水腫現象都明顯低于LR組(P<0.05，見圖2)。

圖1 保存在ETK液、UW液和LR液中3、6、12和24 h后損傷的肌纖維所占百分比比較

圖2 保存在ETK液、UW液和LR液中3、6、12和24 h后損傷的水腫區域比較

2.2 保存液保存6 h后的斷肢再植 在三組ETK、UW和LR保存液6 h保存后移植的模型中，移植8周后的斷肢存活率為100%。血樣本在手術后60 min取得。第8周時，全部的鼠用于電生理學和組織學檢測。三組血清中CPK及鉀的含量見表2。在血清中各組的AST，ALT，LDH，Cr和BUN沒有明顯區別。

表2 保存液中浸泡6 h后移植模型中移植60min后受體血漿CPK及鉀的含量

我們檢查了三組的肌肉潛伏期和振幅[5](見圖3a)。三組沒有明顯的運動延遲區別(見圖3b)，相反，LR組的振幅相比于ETK和UW組顯著降低(P<0.05，見圖3c)。保存在ETK-6 h，UW-6 h或者LR-6 h組中脛骨前肌橫切面見圖4。馬氏三色染色顯示出纖維化區域在三組中沒有明顯區別，而LR組肌肉細胞直徑明顯小于ETK組和UW組(P<0.05)；ETK和LR組的一個明顯區別就是脛骨前肌濕重也有差異(P<0.05，見表3)。

圖3 保存液中浸泡6 h后移植模型中的電生理水平

圖4 保存液中浸泡6 h后移植模型手術后8周時對脛骨前肌橫切面用蘇木精-伊紅及馬氏三色法染色

組 別纖維化區域(%)肌肉細胞直徑(μm)脛骨前肌濕重(g)ETK組2.9±0.8*39.6±8.30.66±0.11UW組3.1±1.2 35.2±5.70.54±0.10LR組4.0±1.5 32.9±6.80.49±0.07注:*與LR組比較,P<0.05

2.3 保存液保存24 h后的斷肢再植 對照組(立刻移植)，ETK組，UW組和LR組移植8周后的斷肢成活率分別為100%，80%，80%，37.5%。我們術后60 min取血樣，檢測CPK和血鉀水平，發現LR組血清中CPK比其他組高出許多(P<0.05，見表4)，8只大鼠中5只在移植60 min后血清CPK水平大于13 000 IU/L并且在前4天死亡。LR組中鉀的含量高于沒有進行保存處理的對照組和ETK組(P<0.05)。四組中血清的AST、ALT、LDH、Cr和BUN沒有明顯差異。

表4 保存液中浸泡24 h后移植模型中移植8周后受體血漿CPK及鉀的含量

我們統計了四組中的電生理波形圖(見圖5a)。LR組內存活的5只鼠中均無電信號。對照組的末端潛伏期相對于其他兩組短，并且UW的末端潛伏期明顯長于ETK組。對照組的振幅高于UW組和ETK組(P<0.05，見圖5b～5c)。在ETK和UW組中，24 h保存后移植的肌肉末端潛伏期和振幅與6 h保存后移植的幾乎相同。

圖5 保存液中浸泡24 h后移植模型中的電生理水平

LR組的纖維化區域(馬氏染色呈藍色)比其他組大(見圖6)。LR組的纖維化區域百分比明顯高于ETK、UW及對照組(P<0.05)，這個結果與6 h組結果相反。LR組肌細胞直徑明顯小于其它三組(P<0.05)。對照組(立刻移植)、ETK組、UW組的脛骨前肌濕重沒有明顯差異(見表5)。

3 討 論

當前用于保存截肢的方法包括將斷肢用含生理鹽水的紗布將其包裹并迅速低溫保存[10]。這個方法本質上與70年前報道的Allen的方法很類似。而新的保存方法在很長時間內都沒有得到發展。已經報道了動物實驗研究肌肉保存及復合材料的組織移植，包括用器官保存液、選擇最佳溫度、移植前對組織進行灌注[11]。這些實驗研究展示了多種有用的保存溶液，但迄今為止仍沒有被廣泛用于保存截肢的保存液。

圖6 保存液中浸泡24 h后移植模型手術后8周時對脛骨前肌橫切面用蘇木精-伊紅及馬氏三色法染色

組 別纖維化區域(%)肌肉細胞直徑(μm)脛骨前肌濕重(g)對照組4.0±0.6*40.1±5.8*0.67±0.11ETK組6.3±1.1*33.6±5.9*0.51±0.08UW組8.5±2.4*31.8±3.7*0.43±0.13LR組29.1±2.5 22.9±5.6 0.23±0.05注:*與LR組比較,P<0.05

保存溶液灌注組織是常用的實體器官保存方式。然而，將灌注法應用于骨骼肌目前仍有爭議[12]。同時，外傷性截斷肢體和手指經常發生在工廠、農場等地方而非醫院。在這些地方，如果沒有合適的器材，將受傷組織浸入保存液是最好的選擇。因此，我們在實驗中選擇了簡單地組織浸泡模型。

這里我們應用了ETK液和UW液來保存肌肉。ETK是一種仿胞外溶液，而UW是仿胞內溶液。我們的數據顯示UW組移植后血清鉀的含量高于ETK組。盡管ETK組和UW組的肢體沒有顯示出明顯的存活率差異，但血鉀過高將可能導致毒血性休克[3，13-14]。因此，仿胞外型溶液由于其低鉀的特點，可能會是保存肌肉組織更好的選擇。ETK溶液也有另外一項優勢：在室溫下其組成成分在三年內十分穩定[15]。而UW液由于會發生谷胱甘肽氧化作用，溶液需要被冷藏并在短時間內使用[16]。所以ETK液用于預防意外的截肢性損傷更有優勢，它可以在救護車及初級診所長期保存。

當下，成功的斷肢移植不止被定義為斷肢處出現血管循環，同時要求肢體功能也被保留下來。一些動物實驗評估了局部缺血-再灌注肢體功能的恢復狀況。Song等報道了狀態良好的大鼠同種異體肢體移植，并采用皮膚反應測試，步態分析和電生理學進行評估[17]。Tsuji等[6]在大鼠肢體移植后進行了電生理學實驗，并發現坐骨神經的遠端運動潛伏期在3周時會伴隨著肢體局部缺血時間延長而上升。這里我們使用電生理學研究保存溶液的效用，結果表明這種方法可能有助于肌肉功能恢復及坐骨神經再生。但是我們的電生理學結果看起來與肌肉萎縮和纖維性變化很類似。

LR組中血清CPK水平明顯高于其他組(P<0.05)，同時，LR組中鉀的含量明顯高于對照組和ETK組(P<0.05)。基于我們的數據，我們提出假設：持續的局部缺血導致了再移植毒血癥，導致腎功能紊亂和心機能不全。相反，ETK和UW溶液會保護肌肉，增強大鼠斷肢肌肉接受再植的能力。綜上所述，我們證明了ETK和UW器官保存溶液可以在斷肢移植時保護肌肉功能和形態，并提高在長時間范圍內受體的存活率，且ETK液更優于UW液。

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