臨床應用軟骨組織工程技術修復關節軟骨缺損的進展

尤奇，段小軍，楊柳，劉毅

(1.遵義醫學院附屬醫院關節外科，貴州 遵義 563003；2.第三軍醫大學西南醫院關節外科，重慶 400038)

關節軟骨缺損在臨床中的發病率極高，是導致肢體殘障的主要原因，并給社會造成了巨大的經濟損失[1]。關節軟骨血液供應的貧乏使得其修復顯得尤為困難，并長期困擾著廣大臨床醫生。該缺損常表現為頑固性疼痛和進行性關節功能減退，最終可引起退行性骨關節炎[2]。Curl等[3]對美國31 516例膝關節損傷患者行關節鏡探查，發現有63%的患者存在不同程度的軟骨損傷。據統計，美國每年有30 000～100 000例軟骨缺損患者需要手術治療[4]。在2000年，美國骨關節炎治療費用達600億美元，預計到2020年骨關節炎花費將增加到1 000億美元[5]。近年來，隨著再生醫學和材料學的迅速發展，軟骨細胞、軟骨組織以及支架材料運用于軟骨缺損的修復均取得了顯著的效果，而且其修復組織的結構和生物力學性能近似透明軟骨。現就軟骨組織工程技術在臨床上的推廣應用進行綜述。

1 傳統治療方法

臨床上治療軟骨缺損的傳統方法很多，但每種方法均有其局限性，并不能很好的滿足臨床要求。a)保守治療雖能夠暫時緩解臨床癥狀，但對于軟骨缺損直徑大于4 mm的患者幾乎無修復作用，更不能恢復其生物學組織結構和功能。b)關節清理術只是對關節局部病灶的清理，僅能改善癥狀并不能修復軟骨缺損。c)骨髓刺激術常用于較小的缺損，形成的多為纖維軟骨，其結構組成和生物力學性能相較于透明軟骨差[6]。d)骨軟骨移植術分為自體骨軟骨移植和同種異體骨軟骨移植，自體骨軟骨移植手術操作簡單而且是一期手術，但面臨著軟骨來源有限和供區并發癥等不足[7]；同種異體骨軟骨移植可以修復較大的軟骨缺損，但存在著免疫排斥和疾病傳播的風險。e)人工關節置換術面臨術后骨溶解、遠期關節功能退變以及費用高等問題。以上治療方法雖能暫時改善關節活動功能，但長期效果還不能滿足臨床要求。

2 軟骨組織工程

隨著材料學、再生醫學以及相關生物化學的迅速發展，Langer等[8]提出了組織工程的概念，組織工程學綜合了材料學、再生醫學以及相關生命科學的基本原理和方法，將分離、提取的細胞體外培養擴增，然后復合于組織相容性良好、可降解吸收的的三維支架材料上，形成具有生物活性的復合物，然后植入體內修復病損部位。近年來，軟骨組織工程技術經過前期大量有效的基礎實驗的驗證，該技術已經應用于臨床，未來有著廣闊的發展前景。

3 新技術的臨床應用

3.1 軟骨細胞移植 軟骨細胞移植(autologous chondrocyte implantation，ACI)是將分離、獲取的自體軟骨細胞先進行體外培養擴增，然后將擴增的細胞按一定的密度移植于軟骨缺損的部位，進行軟骨缺損的修復。研究表明，體外擴增培養的軟骨細胞能夠較好的維持其細胞特性，利于軟骨缺損的修復[9]。ACI對于治療中等軟骨缺損、骨軟骨炎引起的軟骨缺損具有良好的修復效果，但尚不適用于有關節炎癥、傳染性疾病以及局部感染等患者。

1989年，Grande等[10]報道了兔自體軟骨細胞移植治療膝關節軟骨缺損，術后16周軟骨缺損得到修復，并且修復區域表現為透明樣軟骨組織，此為第1代ACI技術，即骨膜-自體軟骨細胞移植術(periosteal autologous chondrocyte implantation，P-ACI)。1994年Brittberg等[11]應用該技術成功治療了人關節軟骨缺損，這為該技術在臨床中的推廣應用奠定了堅實的基礎。1995年美國Genzyme公司利用該技術生產出了Carticel?產品，1997年后該產品逐漸在臨床得到推廣應用。2000年Peterson等[12]報告了101例膝關節軟骨缺損的患者接受ACI治療后的隨訪情況，其中對94例患者進行了2～9年的隨訪，結果證明其臨床有效率達87.5%以上，但術后存在骨膜脫落、細胞逸散、骨質增生、骨膜肥大等并發癥。后來Haddo等[13]用一種Ⅰ/Ⅲ型膠原雙層支架薄膜代替骨膜進行對照研究，通過1年的術后隨訪，該方法取得了良好的臨床效果：不僅無骨膜肥大、剝脫等并發癥，同時此方法避免了因獲取骨膜而增加的額外創傷，該技術被視為第2代ACI技術，即膠原膜-自體軟骨細胞移植術(collagenic autologous chondrocyte implantation，C-ACI)。Niemeyer等[14]對第2代ACI技術(C-ACI)治療的23例膝關節軟骨缺損的患者和第1代ACI技術(P-ACI)治療的23例膝關節軟骨缺損的患者進行了隨訪，術后10年通過Lysholm和IKDC評分進行比較，證明了C-ACI的臨床長期療效要優于P-ACI。Filardo等[15]報道了用C-ACI治療的58例患者，在術后第2年和第6年進行了隨訪，結果顯示膝關節功能得到明顯改善，但存在細胞分布不均勻和膠原膜脫落。隨著組織工程技術的不斷發展，部分學者將軟骨細胞種植于仿生支架材料內形成復合體，然后利用有活性的復合體去修復軟骨缺損，該技術被稱為第3代ACI技術，即基質誘導的自體軟骨細胞移植術(matrix-induced autologous chondrocyte implantation，MACI)。Kon等[16]應用MACI技術對141位患者治療后隨訪，76%的患者疼痛消失，88%的患者運動功能恢復正常。Gille等[17]用MACI技術對38位患者進行了治療，術后15年進行隨訪，結果證實86%的患者膝關節運動功能得到明顯提升，100%的患者膝關節功能都要好于術前。典型代表產品為修復較小缺損的Hyalograft?C(NeoCartTM)和修復較大缺損的Novocart 3D?(NeoCartTM)。最新的MACI使用生物相容性較好的纖維蛋白凝膠進行粘合，避免了術中手術縫合，簡化了以前復雜的操作步驟，縮短了手術時間，降低了細胞外漏的風險，軟骨缺損修復效果更好。有研究者采用患者自體非負重關節的軟骨組織，切成1～2 mm的軟骨片，復合可生物降解的凝膠移植到軟骨缺損處修復缺損，將該技術稱為第4代自體軟骨細胞移植技術。在前期動物實驗研究的基礎上，DePuy Mitek公司制造了自體軟骨移植系統(cartilage autograft implantation system，CAIS)，經美國FDA批準，該技術已應用于臨床研究。Cole等[18]第1次將CAIS應用于臨床研究，分別應用自體軟骨移植和微骨折技術對29例膝關節軟骨缺損患者進行治療，結果表明：在術后6個月、12個月，CAIS組膝關節運動功能明顯好于微骨折組；術后24個月，磁共振檢查兩組缺損修復沒有明顯差異，但微骨折組有較多的骨贅生成。雖然CAIS移植取得了良好的修復效果，但CAIS移植面臨著供區移植組織受限和供區并發癥的缺點。后來，DePuy Mitek公司發起了大規模的臨床研究，但由于收錄注冊的患者數量不足以及資金問題而沒有做長期研究。現將4代ACI技術的優缺點歸納總結見表1。

3.2 成體干細胞移植 間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有成軟骨分化能力，而且體外實驗已經證實具有旺盛的軟骨基質分泌能力[19-20]。MSCs增殖能力較強，復合仿生支架材料后修復軟骨缺損效果較好。因此，MSCs曾被認為是軟骨組織工程比較理想的種子細胞。但后來有學者研究發現，將MSCs分化來源的軟骨細胞體內移植后會出現不同程度的鈣化現象，但出現鈣化的具體原因尚且沒有確切的結論，可能與細胞體外誘導培養后堿性磷酸酶以及X型膠原表達增多有關[21]。

表1 四代ACI技術比較

2002年，Wakitani等[22]將MSCs復合纖維蛋白凝膠治療創傷性膝關節炎，術后24個月關節鏡和組織學檢查結果證實，軟骨缺損被透明軟骨所修復，但遺憾的是患者的臨床癥狀并沒有得到明顯改善。Kuroda等[23]用MSCs復合I型膠原凝膠治療一位股骨內側髁軟骨缺損20 mm×30 mm的患者，術后7個月經過關節鏡及組織學檢查證實，在缺損處有透明軟骨樣組織生成，術后1年患者膝關節功能明顯改善，無疼痛和并發癥發生，但是磁共振檢查結果顯示新生組織表面不規則。Nejadnik等[24]報道對72例膝關節軟骨缺損患者分別用MSCs移植和第1代自體軟骨細胞移植術治療，術后隨訪兩組治療方法都可以改善患者膝關節癥狀，但兩種治療方法的治療結果沒有明顯差別。

MSCs雖然具備取材容易、分離簡單等優點，但仍存在取材部位損傷、干細胞數量有限、形成的修復組織表面不平整等缺點，而且形成的類透明軟骨組織與自體軟骨組織在生物力學性能上還有差距。雖然MSCs移植修復軟骨缺損在動物實驗和臨床應用中還未發現有致瘤性，但這種可能還不能被排除，未來還需進一步觀察和研究。

3.3 同種異體幼年軟骨微粒移植 近年來，同種異體幼年軟骨微粒移植已經應用于臨床研究，特別是在美國臨床中已經取得重要進展。該技術首先獲取捐贈的13歲以下幼年關節軟骨，制作成1 mm×1 mm×1 mm的軟骨微粒備用，當手術確診關節軟骨缺損后，可以一期將軟骨微粒復合仿生凝膠固定于軟骨缺損處，然后按計劃康復訓練，該技術避免了細胞體外培養帶來的表型難以維持等缺陷。Zimmer公司隨后采用該策略開發出軟骨修復移植物商品，即天然組織移植物商品(DeNovo natural tissue，DeNovo-NT)，該產品已經應用于美國臨床。Farr等[25]報道了前瞻性對照研究結果，結果顯示：術后患者的膝關節疼痛癥狀明顯緩解，運動功能明顯提高。對部分患者進行關節鏡探查并取材分析，結論是初步療效滿意。Arshi等[26]和Buckwalter等[27]的近期研究也得出類似的結論。Mcmillan等[28]報道了在全關節鏡下應用幼年軟骨微粒修復全層股骨滑車缺損，該技術避免了傳統膝關節手術所引起的并發癥，但該技術缺少專門的工具能夠使移植物在缺損處分布均勻，而且移植材料或纖維蛋白凝膠有溶解可能。Kruse等[29]用同種異體幼年軟骨微粒治療1例踝關節軟骨缺損的患者，術后6個月踝關節已能完全活動，術后24個月踝關節疼痛癥狀消失，缺損修復良好。Hatic等[30]、Saltzman等[31]的近期研究也得出相似的結論。同種異體幼年軟骨微粒也用于其他關節軟骨缺損的修復，如肘關節、髖關節。Dunn等[32]報道了同種異體幼年軟骨微粒修復肘關節軟骨缺損，術后6個月隨訪，肘關節疼痛減輕，功能改善，MRI檢查顯示軟骨缺損得到修復。Pascual-Garrido等[33]報道了關節鏡下應用同種異體幼年軟骨微粒修復髖關節軟骨缺損，術后12個月隨訪證實，髖關節活動功能明顯改善，疼痛消失，軟骨缺損得到修復。有報道稱同種異體幼年軟骨微粒移植對于中度的髖關節軟骨缺損(2～5 cm2)有較好的修復效果，但缺乏長期的臨床追蹤報道結果，因此，還不能對其遠期療效做出客觀評價。

該技術為異體來源組織，理論上存在疾病傳播、免疫排斥、移植物加工過程污染等風險，而且該技術的一些關鍵的修復機制尚待闡明，目前尚未見中國大陸應用該技術修復軟骨缺損的研究報道。

3.4 應用新型生物材料 隨著支架材料的深入研究，有研究者提出了用無細胞仿生支架修復軟骨缺損的新方法。2013年Schüettler等[34]通過關節鏡手術用無細胞的I型膠原支架治療1例膝關節軟骨缺損的患者，術中患者軟骨下骨保存完整，術后42個月隨訪，患者膝關節運動功能提高，疼痛癥狀消失，MRI顯示缺損得到修復。修復組織HE染色有軟骨細胞生成，新生組織免疫組化檢測結果顯示有新生的Ⅱ型膠原。后來，Filardo等[35]報道用I型膠原和羥基磷灰石構成的具有通透性的三維支架治療27例剝脫性骨軟骨炎的患者，術前采用開放性手術暴露軟骨缺損并清除硬化的軟骨下骨，術后2年隨訪膝關節功能改善明顯，磁共振顯示軟骨缺損得到修復，但大部分患者有不均勻的再生組織和軟骨下骨的形態改變。Brix等[36]通過關節鏡手術用無細胞的納米支架治療8例膝關節軟骨缺損的患者，術中清除部分軟骨下骨，術后分別于12、18、24個月進行隨訪，有7例患者無細胞支架與周圍骨完全愈合，5例患者有軟骨下骨化，磁共振檢查結果顯示修復組織并非是透明軟骨樣組織。

新型生物材料的應用避免了細胞提取、分離的復雜步驟，避免了軟骨細胞體外培養表型不穩定的缺點，為臨床修復關節軟骨缺損提供了新思路和新方法。然而，該技術修復軟骨缺損有軟骨修復不全、軟骨形態改變和骨贅形成等缺點，這些缺點導致該技術未能在臨床進一步推廣應用。單純的支架材料，其成軟骨修復活性往往不足，還不能很好的滿足臨床需求，有基礎研究提示復合生長因子后可提高軟骨修復能力，但是有關該技術臨床的有效性及安全性尚未知曉。

4 臨床應用進展

目前文獻報道的主要治療關節是膝關節，Siebold等[37]將自體關節軟骨細胞體外培養形成三維微球體，然后移植于30例患者軟骨缺損處，術后進行隨訪，86.6%的患者生活質量得到明顯提高，疼痛減輕，膝關節功能改善，Mocart評分和磁共振影像證實膝關節穩定性良好。Mumme等[38]第1次將人的自體鼻軟骨細胞用于膝關節軟骨缺損的治療，他們將體外再生成軟骨能力更好的鼻軟骨細胞復合于膠原支架上，然后移植于25例患者膝關節軟骨缺損處，術后24個月隨訪，患者疼痛癥狀減輕，膝關節運動功能明顯提高，新生的軟骨組織結構和生物力學性能接近于正常組織。該實驗還需對其遠期療效做進一步觀察，觀察是否能夠抑制或消除骨關節炎的發生。踝關節、肘關節、髖關節有少數報道，Dunn等[32]、Pascual-Garrido等[33]也報道了肘關節、髖關節軟骨損傷的修復結果。

5 展 望

軟骨組織工程技術應用于關節軟骨缺損雖然僅有短短30余年，但已展現出廣闊的臨床應用前景。近年來，隨著再生醫學、材料學以及生物化學的迅速發展，組織工程技術已從基礎研究轉化應用到臨床。傳統的治療方法雖能改善癥狀，但并不能形成組織結構和生物力學性能類似于透明軟骨的組織。應用組織工程技術不僅能夠明顯改善癥狀，而且能夠形成透明軟骨樣組織，其生物力學性能接近于自體軟骨組織。然而，還要認識到該技術目前所面臨的問題，例如：a)自體軟骨來源受限、供區不穩、供區并發癥；b)軟骨細胞體外擴增，表型不穩定出現肥大化；c)支架材料存在機械強度和組織誘導活性不足；d)組織界面整合欠佳；e)遠期觀察新生組織容易退變等[12]。因此，未來還需進一步探討種子細胞、支架材料以及體內修復機制等。一旦以上關鍵問題得到解決，該技術將會很快在臨床得到推廣和普及。

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