骨骼肌中與運動相關(guān)蛋白質(zhì)組學的研究進展

張海濱 田雪文

運動訓練作為最佳的非藥物學策略，在多種病理生理條件下能夠預防或減輕骨骼肌萎縮及損傷，對機體健康產(chǎn)生積極效應。骨骼肌對收縮刺激具有顯著的可塑性。在不同運動訓練刺激下，骨骼肌分子和形態(tài)產(chǎn)生不同適應性，以滿足其功能需求。盡管運動可以促進骨骼肌在收縮特性、線粒體功能和血管生成等方面的重塑，但運動誘導骨骼肌重塑反應的信號通路和分子學機制尚未明確。由于基因僅僅是遺傳物質(zhì)的載體，同一組基因在不同階段或環(huán)境下轉(zhuǎn)錄翻譯后表達的蛋白質(zhì)不同，所產(chǎn)生的生理功能不同。隨著后基因時代的發(fā)展，蛋白質(zhì)組在基因組基礎上被提出，蛋白質(zhì)組學研究開始受到國內(nèi)外科研工作者的青睞。蛋白質(zhì)組學是在特定刺激條件下，對單一細胞或組織基因組翻譯后表達的所有蛋白質(zhì)特質(zhì)進行分析的科學。基于質(zhì)譜和生物信息學的蛋白質(zhì)組學，能夠確定與運動訓練相關(guān)的骨骼肌重塑潛在分子標記，綜合觀察運動刺激反應的分子通路，更好的解釋運動訓練對骨骼肌重塑的影響。本文通過綜述蛋白質(zhì)組學相關(guān)技術(shù)，及其對運動訓練誘導骨骼肌重塑的影響，以促進蛋白質(zhì)組學相關(guān)技術(shù)在運動人體科學領域的應用。

1. 骨骼肌差異蛋白分析的蛋白質(zhì)組學技術(shù)

蛋白質(zhì)組學能夠分析骨骼肌復雜混合物中的單個蛋白質(zhì)，因此可以更深入地了解肌肉多樣性和可塑性。然而因肌纖維類型不同、骨骼肌之間異質(zhì)性以及方法學方面的因素，對骨骼肌進行全面蛋白質(zhì)組學分析仍存在一定的挑戰(zhàn)。骨骼肌作為高能量需求的重要組織，線粒體無疑成為蛋白質(zhì)組學研究的重點。骨骼肌釋放的作用于機體局部或全身的分泌蛋白也是蛋白質(zhì)組學研究的目標。借助差速離心、流式細胞術(shù)等分離純化技術(shù)提取出骨骼肌或其亞細胞蛋白質(zhì)組樣品，就可使用基于凝膠或非凝膠方法結(jié)合標記或無標記的定量策略進行大規(guī)模蛋白質(zhì)組學研究。蛋白質(zhì)組學研究主要涉及蛋白質(zhì)組表達模式和蛋白質(zhì)組功能模式兩方面的研究，目前大部分集中在蛋白質(zhì)組表達模式方面。這方面的蛋白質(zhì)組學相關(guān)技術(shù)主要指蛋白質(zhì)分離技術(shù)，質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學。

1.1 蛋白質(zhì)組的凝膠分離技術(shù)

雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)是分離蛋白質(zhì)最常用的蛋白質(zhì)組學技術(shù)。其原理是第一向中根據(jù)蛋白質(zhì)在特定PH環(huán)境的等電點不同利用等電聚焦分離，在第二向中則按照其分子量不同利用SDS-PAGE分離，將骨骼肌復雜混合物中的單個蛋白質(zhì)在二維平面上分開。雙向差異凝膠電泳技術(shù)(2D-DIGE)是一種熒光標記定量蛋白質(zhì)組學技術(shù)。2D-DIGE是唯一使用內(nèi)參標志物，并支持在一張凝膠中分離多個樣品且單個成像的蛋白電泳分離技術(shù)。該技術(shù)基于蛋白質(zhì)賴氨酸殘基中加入不同熒光的氰化物染料用來標記不同蛋白質(zhì)組學樣品，隨后利用2-DE技術(shù)進行同位素分離保證了樣品所有蛋白質(zhì)位置的共同移動，從而減少凝膠或凝膠變異產(chǎn)生的潛在錯象。2D-DIGE分離后用胰蛋白酶對存在于凝膠中條帶或斑點酶切以及質(zhì)譜分析，可鑒定大約3500個蛋白質(zhì)點，這為深入研究蛋白質(zhì)組學提供了更多機會。在高強度運動訓練(HIT)誘導骨骼肌適應性的2D-DIGE蛋白質(zhì)組學分析顯示，鑒定出的800個檢測點和匹配點中，HIT組與久坐組相比有13個蛋白質(zhì)發(fā)生變化。

1.2 蛋白質(zhì)組的非凝膠分離技術(shù)

隨著蛋白質(zhì)組學研究的深入，突破凝膠電泳中等電點和分子量限制的非凝膠蛋白分離技術(shù)，能夠在更廣泛的動態(tài)范圍內(nèi)覆蓋蛋白質(zhì)組。具有正交分離能力的多維液相色譜法(MDLC)被廣泛使用。最典型的是復合肽混合物通過二維液相色譜(2D-LC)結(jié)合強陽離子交換和反相，允許肽借助電荷和疏水性完成分離。將高效液相色譜柱用自動串聯(lián)質(zhì)譜儀鑒定，可有效減少樣品損失量分析出低豐度蛋白質(zhì)，提高蛋白質(zhì)組分離成功率。Sollanek等人在運動誘導膈肌表型變化的研究中，使用非標記液相色譜-質(zhì)譜法對膈肌中分離的可溶性蛋白質(zhì)和線粒體蛋白質(zhì)分析顯示，膈肌膜蛋白質(zhì)總數(shù)分別是813和732。耐力運動訓練顯著改變可溶性膜蛋白組中70種蛋白和線粒體蛋白組中25種蛋白質(zhì)的豐富度。

1.3 蛋白質(zhì)組學的凝膠液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)

為了進一步提高蛋白質(zhì)組的分離效率，將凝膠和液相色譜結(jié)合使用的凝膠液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)實現(xiàn)了對蛋白質(zhì)的多維分離鑒定。其操作流程一般是通過電泳分離蛋白質(zhì)，切取凝膠中蛋白條帶或斑點，首先進蛋白酶酶切，最后借助液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS/MS )鑒定蛋白質(zhì) 。同位素的相對與絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ) 技術(shù)通過2-DE凝膠差異蛋白分析結(jié)合1-DE凝膠泳道中胰蛋白酶肽的定量分析，對骨骼肌中多達4或8個樣品多重分析，實現(xiàn)差異蛋白評估。iTRAQ標記是在肽水平上完成的，蛋白質(zhì)定量則基于離子強度或MS / MS分析后鑒定蛋白質(zhì)的光譜計數(shù)。Holloway 等人采用iTRAQ技術(shù)在股外側(cè)肌運動訓練干預前后的活檢研究中發(fā)現(xiàn)，2-DE解析了256個蛋白質(zhì)點，配對t檢驗發(fā)現(xiàn)了20個表達差異。盡管使用高分辨率質(zhì)量分析的混合質(zhì)譜儀對定量蛋白質(zhì)組學進行了改進，但其高昂的成本費用，標記效率的可變性以及低豐度肽的低分辨率等不同程度局限該技術(shù)的廣泛應用。在運動誘導骨骼肌蛋白質(zhì)組可塑性的表征中獲得的大部分數(shù)據(jù)來自2-DE研究。

1.4 蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)的生物信息學

蛋白質(zhì)組學研究的主旨是通過對差異表達蛋白的分離鑒定，描繪出骨骼肌在特定條件刺激下的調(diào)節(jié)分子通路。蛋白質(zhì)組學信息學通過對蛋白質(zhì)組實驗數(shù)據(jù)的收集和加工，構(gòu)建雙向電泳圖譜數(shù)據(jù)庫能夠優(yōu)化蛋白鑒定；并且輔助分析蛋白質(zhì)之間的相互作用，構(gòu)建出機體蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡。BINGO和ClueGO等生物信息學工具描繪了鑒定出的蛋白質(zhì)潛在功能和機體生理變化的動態(tài)相關(guān)性，有助于闡明運動訓練誘導骨骼肌重塑反應的分子學機制。

2. 運動對骨骼肌蛋白質(zhì)組學的影響

運動對骨骼肌重塑起到了良好的促進作用，運動作為獨立的外界環(huán)境應激因素能夠引起骨骼肌產(chǎn)生不同程度的收縮反應。骨骼肌對收縮刺激具有顯著的可塑性，蛋白質(zhì)組學隨之發(fā)生變化。從蛋白質(zhì)組水平研究骨骼肌在運動適應中的變化，蛋白質(zhì)組學技術(shù)能夠從動態(tài)、整體的視角更好的揭示了骨骼肌在運動反應和適應過程中蛋白質(zhì)組的變化特征。這可能發(fā)現(xiàn)新的骨骼肌損傷標記物，對預防骨骼肌損傷具有重要意義。

2.1 有氧運動對蛋白質(zhì)組學的影響

有氧運動對骨骼肌重塑的促進作用，主要體現(xiàn)在對線粒體能量代謝和細胞膜修復相關(guān)蛋白豐度的提高。尹苗苗等人在有氧運動對小鼠骨骼肌蛋白表達影響的研究中發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)組學鑒定出6種與線粒體能量代謝、細胞膜修復和糖代謝相關(guān)的差異性蛋白表達均成倍上調(diào)，這提示有氧運動與骨骼肌重塑密切相關(guān)。Kurt等人研究運動誘導膈肌表型變化的結(jié)果顯示，耐力運動訓練后幾種關(guān)鍵蛋白的豐度相對增加，包括線粒體蛋白18(MTP18)、3-巰基丙酮酸硫酸轉(zhuǎn)移酶(3MPST)、微粒體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶3(Mgst3)和熱休克蛋白70kDa蛋白1A / 1B(HSP70)。這些蛋白在幾種細胞類型中具有細胞保護作用，盡管在膈肌纖維中的細胞保護作用尚未完全被闡明，但是暗示了耐力運動預防非活動性肌肉萎縮的功能。Simona等人在研究低強度耐力運動恢復mdx小鼠受損骨骼肌的研究中發(fā)現(xiàn)，與久坐mdx小鼠相比，進行鍛煉的mdx小鼠股四頭肌中有四個蛋白質(zhì)點顯著改變。經(jīng)蛋白質(zhì)組學鑒定為三種碳酸酐酶3(CA3)同系物和超氧化物歧化酶(SODC)。在鍛煉的mdx小鼠股四頭肌中，CA3亞型的蛋白水平明顯上調(diào)，并完全恢復到野生型(WT)小鼠的值。而SODC的蛋白水平顯著下調(diào)，并恢復到WT小鼠的值。根據(jù)本研究中發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)，低強度耐力運動似乎可以通過對抗氧化應激來減少mdx肌肉中的細胞退化過程。另有研究表明，骨骼肌對運動訓練的主要反應是線粒體電子傳遞鏈，三羧酸循環(huán)和線粒體呼吸鏈復合物I裝配的蛋白質(zhì)更豐富。而肥胖/2型糖尿病(T2DM)個體中這三類蛋白質(zhì)豐度較低，并且耐力訓練的個體骨骼肌更豐富。這提示運動誘導機體防御肥胖和葡萄糖不耐受和T2DM的有害作用主要機制之一發(fā)生在電子傳遞鏈的復合物I上。

2.2 無氧運動運動對蛋白質(zhì)組學的影響

無氧運動引起骨骼肌差異蛋白的數(shù)量相對較少。Kym等人，應用定量蛋白質(zhì)組學研究個體腓腸肌蛋白的水平是否受短時間高強度運動影響時發(fā)現(xiàn)，腓腸肌蛋白質(zhì)水平一般不受短時間高強度運動的急劇影響，雙向凝膠電泳選擇的61個蛋白質(zhì)點中僅有4中顯著變化。使用液相色譜電噴霧電離-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定這些變化的蛋白質(zhì)為肌酸激酶，肌鈣蛋白，熱休克20kDa蛋白和腺苷酸激酶1的組合。這也表明，大多數(shù)個體骨骼肌蛋白質(zhì)水平不會立即改變，以相應短時間的高強度運動，也提示定量蛋白組學對于檢測骨骼肌蛋白水平的劇烈變化非常敏感。同樣地，Yamaguchi等人研究大鼠進行游泳高強度間歇后骨骼肌適應性變化時發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)組學分析顯示，在800個檢測點和匹配點中，與對照組大鼠相比，高強度間歇游泳后大鼠只有13個蛋白質(zhì)表現(xiàn)出變化。此外，利用western免疫印跡分析，高強度間歇運動對呼吸鏈電子傳遞相關(guān)蛋白(NDUFS1)和小清蛋白(parvalbumin ，PV)的表達進行了顯著改變。

3. 總結(jié)

綜上所述，運動訓練能夠誘導骨骼肌蛋白質(zhì)組產(chǎn)生適應性變化。蛋白質(zhì)組學技術(shù)除了檢測差異蛋白質(zhì)外，更加深入的探討運動誘導的骨骼肌蛋白質(zhì)組和疾病之間的交流受到越來越多的關(guān)注。