梨樹PyS6PDH2基因的克隆及其在不同樹形條件下的表達(dá)分析

劉政+林世華+安莉園+秦仲麒+伍濤+李先明+涂俊凡+楊夫臣+朱紅艷+楊立

摘要：山梨醇是梨樹等薔薇科植物光合作用初級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)物。6-磷酸山梨醇脫氫酶（S6PDH）是山梨醇合成過程中的關(guān)鍵酶，但是其在不同樹形中的調(diào)控作用尚未闡明。結(jié)果表明，PyS6PDH2基因包含933 bp的開放讀碼框，編碼310個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為34.9 ku，理論等電點(diǎn)為8.73，具有親水性。PyS6PDH2的氨基酸序列與其他薔薇科植物的S6PDH具有高度的同源性。PyS6PDH2蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)元件包括α-螺旋（42.58%）、β-轉(zhuǎn)角（9.03%）、延伸鏈（18.39%），和不規(guī)則盤繞（30.00%）。表達(dá)分析表明PyS6PDH2基因在棚架樹形葉中的表達(dá)水平高于疏散分層形，該基因可能是通過促進(jìn)山梨醇合成從而提高棚架樹形的果實(shí)品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：梨樹；PyS6PDH2基因；山梨醇合成；樹形；克隆；qRT-PCR

中圖分類號(hào)：Q78；S661.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）24-4902-05

目前中國(guó)梨生產(chǎn)面積基本已穩(wěn)定在112萬hm2左右，產(chǎn)量達(dá)到1 869.9萬t。然而現(xiàn)存的老梨園多采用傳統(tǒng)的多主枝疏散分層形，其樹體高大，枝量重疊，樹冠郁閉，病蟲害問題嚴(yán)重。隨著中國(guó)勞動(dòng)力成本不斷攀升以及老齡化問題日漸凸顯，許多果園精細(xì)化管理水平得不到有效保證，制約了優(yōu)質(zhì)果品的生產(chǎn)[1]。因此，發(fā)展輕簡(jiǎn)化、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)整形模式是果園栽培管理的必然趨勢(shì)。

光照條件是決定果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量最重要的關(guān)鍵因素之一[2]。良好的樹形結(jié)構(gòu)可以提高光合有效輻射（Photosynthetically active radiation，PAR）在冠層內(nèi)的滲透和分布，促進(jìn)光合作用合成產(chǎn)物更有效地從葉（源）向果實(shí)（庫(kù)）積累，從而提升果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)[3-5]。此外，整形不僅能夠調(diào)節(jié)冠層微氣候，通風(fēng)透光，降低相對(duì)濕度，減少病害的發(fā)生率[6]，還能夠促進(jìn)花芽分化，影響葉蒸騰作用，增加果實(shí)糖分、花青素以及總酚含量[7]。為了明確整形模式對(duì)果實(shí)品質(zhì)的影響，Asadollsh等[8]對(duì)5種樹形條件下的“Golden Delicious”蘋果樹營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)（樹高度、新稍生長(zhǎng)量、主干直徑、樹冠擴(kuò)張量）和果實(shí)品質(zhì)（大小、單果重、硬度、風(fēng)味、芳香、可溶性固形物、可滴定酸、產(chǎn)量）進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)不同的樹體結(jié)構(gòu)明顯影響了果實(shí)品質(zhì)，且細(xì)長(zhǎng)紡錘形果實(shí)產(chǎn)量最高；Pasa等[9]分析了桃的3種樹形，發(fā)現(xiàn)“中心領(lǐng)導(dǎo)干”樹形在早期產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)回報(bào)上高于其他兩種樹形。

梨樹傳統(tǒng)的樹形多樣，包括疏散分層形、開心形、自然圓頭形、Y字形等。近幾年來，梨棚架栽培模式由于操作管理方便，便于標(biāo)準(zhǔn)化和機(jī)械化生產(chǎn)而被廣泛推廣，其光照和通風(fēng)條件好被認(rèn)為是果實(shí)單果質(zhì)量高、商品性好的原因[10]。目前本課題組以及國(guó)內(nèi)外同行已從生理水平的角度比較了不同樹形對(duì)梨光合作用和果實(shí)產(chǎn)量及品質(zhì)的影響[1，11-14]，然而梨樹樹形調(diào)控果實(shí)品質(zhì)的相關(guān)基因研究尚未報(bào)道。分離并克隆樹形調(diào)控光合產(chǎn)物積累的關(guān)鍵基因，有望為解析其調(diào)控機(jī)理提供理論支持。

山梨醇是梨等多種薔薇科木本植物最主要的光合產(chǎn)物，也是向果實(shí)運(yùn)輸最重要的碳水化合物運(yùn)輸形式和儲(chǔ)藏物質(zhì)，并與改善果實(shí)風(fēng)味密切相關(guān)[15，16]。6-磷酸山梨醇脫氫酶（Sorbitol-6-phosphate dehydrogenase，S6PDH；EC 1.1.1.200）在山梨醇合成過程中起著催化6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸山梨醇的作用，其活性伴隨著山梨醇的積累并且在葉片中有較高的表達(dá)[17]。研究者在蘋果葉片中克隆了S6PDH基因，發(fā)現(xiàn)該基因在子葉中的活性高于其他器官[18，19]。完全成熟的桃葉片中S6PDH基因表達(dá)水平以及其的酶活性和蛋白水平均高于幼嫩葉片，表明該基因的表達(dá)與葉片源強(qiáng)密切相關(guān)[20]。Kim等[21]克隆出了編碼310個(gè)氨基酸序列的PyS6PDH基因，其在花后30 d的梨葉片組織高表達(dá)，并在之后的時(shí)期呈現(xiàn)有波動(dòng)的下降表達(dá)；高溫對(duì)PyS6PDH基因表達(dá)水平在梨葉中有抑制作用，但是其在果實(shí)中表達(dá)沒有明顯的影響[22]；提高鉀含量能明顯提高梨葉片和果實(shí)的山梨醇及S6PDH基因表達(dá)水平[23]。

梨基因組測(cè)序工作的完成（http：//peargenome.njau.edu.cn/）能迅速功能基因的挖掘[24]。本研究利用基因組序列信息，克隆出了一個(gè)新的S6PDH基因，并對(duì)該基因進(jìn)行了序列分析，采用qRT-PCR技術(shù)分析其在不同樹形的葉片組織中的表達(dá)模式差異，為進(jìn)一步解析該基因在整形模式調(diào)控光合產(chǎn)物積累過程中的作用提供分子水平上的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2016年在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所金水基地梨育種試驗(yàn)園進(jìn)行。供試材料為八年生的疏散分層形和“雙臂順行式”棚架樹形的圓黃梨（Pyrus pyrifolia Nakai. cv. Wonhwang）葉片，兩種樹形的梨樹樹勢(shì)相似，施肥、灌溉、病蟲防治等管理水平相對(duì)一致。取樣方法參照王少敏等[25]，每株樹從各方向選擇中上部生長(zhǎng)一致的枝梢，從頂部下數(shù)第5～7片完全展開的功能葉混合成1個(gè)樣本池。分別在花后50、80、110、140 d取樣，立即放入液氮速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.2 總RNA提取、檢測(cè)與cDNA合成

采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Tiangen，China）提取各樣本的總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoPhotometerTM Spectrophotometer（IMPLEN，Germany）評(píng)價(jià)RNA的完整性并檢測(cè)其濃度。以總RNA為模板，使用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，USA）進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.3 基因的克隆與序列分析endprint