環狀RNA及其在畜禽中的研究進展

吳　艷，潘愛鑾，杜金平，皮勁松，梁振華，申　杰，張　昊，蒲躍進，孫　靜

(1. 湖北省農業科學院 畜牧獸醫研究所 湖北省農業科技創新中心，武漢　430064；2. 動物胚胎工程與分子育種湖北省重點實驗室，武漢　430064)

環狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類新發現的內源性非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，最早于1976年在某些高等植物中被發現[1]。與傳統的線性RNA(linear RNA，含5′和3′末端)相比，circRNA的不同在于其5′和3′端以共價鍵連接在一起呈封閉環狀結構，不受RNA外切酶影響，表達更穩定、不易降解[2]。近幾年的研究結果顯示circRNA在調控人類基因中展現出巨大的潛能[3]，使其成為RNA領域最新的研究熱點。早期的研究認為，circRNA是正常的編碼RNA剪接發生錯誤而導致的產物[4]，但隨著研究的深入，這種觀點已經發生改變。已有研究表明，circRNA主要通過稱之為反式剪接的過程產生，在此過程中，下游的外顯子同上游的外顯子發生反向剪接，即一個剪接受體與主轉錄本上游的剪接供體相結合，形成一個環形的副本；在各種不同類型的動物和植物細胞中，circRNA來源于蛋白質編碼基因和非編碼基因[5]。在哺乳動物中的研究證明，circRNA來源于蛋白質編碼基因的外顯子并且發揮miRNA(microRNA)海綿的作用[6]。最新研究發現，在動物體內RNA的環化與前體mRNA的剪接存在競爭抑制關系，以此來保持組織特異性基因的表達[7]。然而circRNA的主要作用仍不清楚。本文主要綜述circRNAs的來源、特征、形成機制、主要功能、研究方法及其在畜禽中的研究進展，并對circRNA在畜禽中的研究前景進行展望，為進一步研究circRNAs提供一定的理論基礎與技術支撐。

1　circRNA的形成機制

circRNA在真核生物中主要通過一種反向可變剪接，使基因的外顯子序列反向首尾連接形成環狀RNA。其形成方式包括外顯子來源的circRNA(exonic circular RNA)、內含子來源的circRNA(intronic circular RNA)及由外顯子和內含子共同組成的circRNA(exonic -intronic circular RNA, ElciRNA)。

1.1　外顯子來源circRNA和ElciRNA的形成機制

關于exonic circRNA 和ElciRNA的形成機制主要有3種：直接反式剪接、外顯子跳躍和內含子配對驅動的環化。直接反式剪接是由同一個外顯子下游的3′端和上游的5′端相結合，使下游的供體與上游的配體配對，從而使外顯子環化形成circRNAs；外顯子跳躍需要通過內含子跳讀產生一個包含外顯子的套索，套索內部通過拼接將內含子切除從而產生circRNAs[8]；內含子配對驅動的環化是位于兩個外顯子側翼的內含子之間存在互補序列，其可直接通過堿基配對誘導環化形成circRNA。此外，有研究表明，RNA通過側翼內含子與個體內含子形成配對競爭，以保證外顯子環化的效率[9]；環化剪接和線性剪接之間存在競爭，從而使circRNAs具有基因調控的功能[10]。

1.2　內含子來源circRNA的形成機制

根據內含子剪接機制的不同，可將內含子分為自我剪接內含子、酶促剪接內含子及核mRNA前體內含子。其中，自我剪接內含子可分為Ⅰ類內含子、Ⅱ類內含子，機體內的內含子circRNAs主要由這兩類內含子剪接而成。Ⅰ類內含子參與常規剪接：結合在內含子上的一個外源鳥苷作為親核體與5′剪接位點相作用，從而形成環狀RNA；Ⅱ類內含子介導的circRNA的形成：環狀的形成需要3′端外顯子釋放，內含子末端的3′-OH攻擊5′堿基位點，2′-5′磷酸二酯鍵形成從而產生一個環狀RNA[11]。

2　環狀RNA的特征與主要功能

2.1　環狀RNA的特征

由于早期研究技術限制，只有少數環狀RNA被發現，豐富性較低。近年來的研究發現，在多種生物細胞和組織中，有超過10%的表達基因能夠產生circRNA[12]，表明circRNA是一類古老、在真核基因中保守的分子[13]。此外，circRNA還具有以下特征：大部分屬于非編碼RNA[14]；主要由外顯子衍生而來[15]；同一基因位點或許可通過選擇性環化產生多種circRNAs[16]；比線性RNA穩定，不易降解[17]。circRNA的這些特性表明其具有重要的生物功能。

2.2　circRNA的主要功能

近年來的研究表明circRNA具有較高的豐富性，但是其生物學功能仍需不斷研究。目前，circRNA的功能主要包括以下幾個方面：

2.2.1miRNA海綿作用miRNA是一類長度在21 nt左右的RNA，它們可以通過堿基互補配對直接與mRNA靶標相結合，從而起到抑制mRNA翻譯的作用[18]。由于circRNA擁有miRNA結合位點，其可以通過吸附特定的miRNA，競爭性抑制miRNA與靶標結合的能力[19]。已有的研究證明，大多數circRNA具有多個miRNA結合位點[3,20]，但circRNA是否普遍具有miRNA海綿作用還有待進一步驗證。

2.2.2調節轉錄、參與蛋白合成circRNA除能夠調控miRNA外，還可與RNA結合蛋白相結合形成 RNA蛋白復合物，對RNA結合蛋白和miRNA起調節作用或者通過部分堿基互補配對直接作用于靶基因[21]。Chen等[22]研究證明circRNA具有編碼蛋白質的功能。由于circRNA沒有ploy(A)尾的結構，不易從尾端被降解，從而證明circRNA在調控RNA轉錄和蛋白質合成上可能具有關鍵性的作用[23]。此外，有研究表明circRNA還具有存儲、定位RNA結合蛋白的功能[24]。

3　circRNA的研究方法

對circRNA 的研究主要包括circRNA 的鑒定、circRNA 的表達和生物學功能研究。circRNA 的鑒定依賴于多種檢測工具，目前已有的circRNA 檢測工具和算法包括MapSplice[25]、PredcircRNA[26]、UROBORUS[27]、NCLscan[28]、circRNA_finder、find_circ、CIRC explorer和CircSeq等[20,29]。上述工具對circRNA 檢測的精確度和靈敏度各不相同，聯合使用可有效預測circRNA。

目前已有大量的circRNAs 被檢測出來，并建立多個circRNA 數據庫，包括circBase (http://www.circbase.org/)[30]、circRNABase (http://starbase.sysu.edu.cn/mir-CircRNA.php)[31]、Circ2Traits (http://gyanxet- beta.com/circdb)[32]、circ-Net (http://circnet.mbc.nctu.edu.tw/)[33]、deepBasev2.0 (http://deepbase.sysu.edu.cn/)[34]、Circ Interactome (http://circinteractome.nia.nih.gov/)[35]等。上述數據庫收錄了已發表的circRNA 數據，并對新的circRNAs及circRNA 與miRNA的潛在結合位點和相互作用關系進行預測，構建circRNA 表達圖譜和miRNA-circRNA、circRNA-RNA結合蛋白(RBP)互作網絡，為開展circRNA的功能研究提供有用的工具。

circRNA 表達及生物學功能研究利用常規生物學技術，如實時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)、載體構建、蛋白印記(Western blot)、免疫組化(Immunohistochemistry staining)、RNA 印跡(Northern blot)等結合生物信息學軟件，分析circRNA 在不同組織中的表達差異，預測circRNA 與miRNA 的潛在結合位點，探究circRNA 在疾病或某些生理過程中的作用機制，為更深入了解circRNA的功能提供技術支持。

4　circRNA在畜禽中的研究進展

目前，有關circRNA的研究主要集中于疾病(尤其是癌癥)方面[36-42]，關于動物尤其是畜禽的相關研究報道相對較少。在家畜方面，Ven等[43]研究發現circRNA在胚胎期豬的腦發育過程中具有重要的調控作用。Zhang等[44]研究產后90 和250 d的奶牛乳腺組織中差異表達的circRNA，結果發現來源于酪蛋白的差異circRNA在奶牛乳腺組織中高表達，提示其可能參與酪蛋白的表達調控。Sun等[45]研究藍塘豬和長白豬肌肉組織中差異表達的編碼基因、LncRNA、circRNA及miRNA，結果發現差異表達的circRNA其236個來源基因中有93個是與肌肉發育相關的主要功能基因。Tao等[46]研究發現麻城黑山羊和布爾山羊排卵前的卵泡組織中共有37個差異表達的circRNA，其中chi_circ_0008219可與3個卵泡相關的miRNA相結合，提示circRNA對母羊卵巢卵泡有潛在的影響。Li等[47]研究產前和產后綿羊腦垂體中差異表達的circRNA，結果表明大量的circRNA與垂體特異性的miRNA相互作用并參與腦垂體的生物學功能。Wei等[48]分析胚胎期和成年牛的背最長肌中差異表達的circRNA，結果發現過表達circLMO7抑制初生牛的成肌細胞分化，其通過競爭性結合miR-378a-3p發揮作用。Li等[49]利用RNA-seq方法研究胚胎期和生產后綿羊背最長肌組織中的circRNA，分析結果發現差異表達的circRNA其來源基因主要富集于肌肉生長和發育相關的信號通路。而在家禽方面，關于circRNA的相關研究報道僅見Zhang等[50]發現circRNA的改變參與雞禽白血病J亞型引起的腫瘤形成過程，其他方面的研究還未見報道。

5　展 望

目前對于circRNA 的研究尚處起步階段，有大量問題需要被進一步闡明。隨著高通量測序技術和生物信息學的快速發展，越來越多的circRNA被鑒定，circRNA的功能研究越來越深入。近年來研究發現circRNA與疫病發生密切相關，可以作為未來癌癥等疾病檢測的新型標志物[51-52]。在畜禽方面，近年來對circRNA的研究主要集中在與經濟性狀相關的circRNA的研究上。鑒于circRNA在基因表達調控中的重要作用，深入開展與畜禽經濟性狀(包括肌肉發育、肉質、繁殖、脂肪沉積等)相關的circRNA的鑒定與功能研究，為更好地了解和開展畜禽分子育種提供理論依據和技術指導。

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