miRNA-33對脂代謝的調節

張海濱 朱磊

機體脂代謝是受相關調控因子嚴格控制的生理機制，一旦發生脂代謝紊亂就會導致肥胖以及動脈粥樣硬化等疾病，嚴重影響 人體健康水平。miRNA在脂代謝相關疾病中能夠抑制基因表達，從而調節病理進程。其中，miR-33是生物體脂代謝發揮調節作用的重要控制基因。miR-33能夠維持體內膽固醇動態穩定，參與高密度脂蛋白(HDL)生成，以及調節脂肪酸氧化和胰島素信號釋放。目前國內外研究公認，低氧暴露、低氧訓練能夠有效改善機體脂代謝水平。最新研究表明，低氧訓練通過抑制miRNA在肥胖大鼠肝臟表達水平，參與脂代謝生理過程。低氧暴露能夠顯著降低血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)的含量，顯著升高高密度脂蛋白(HDL)的含量，增加血清中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。低氧訓練可使肥胖SD大鼠肝臟膽固醇逆轉運至血液中，并促進脂肪酸氧化。在研究過程中，缺氧訓練顯著降低了miR-33在大鼠肝臟中的表達，但對miR-33在低氧訓練調控脂代謝通路中的具體功能尚未進行深入研究。本文通過對miR-33，miR-33與脂代謝，以及低氧訓練對脂代謝的調節進行綜述，探討低氧訓練誘導miR-33調控脂代謝通路的可能機制，為低氧訓練減重降脂和脂代謝相關疾病的干預提供理論依據。

1. miRNA的生物合成及轉錄

miRNA在哺乳動物的生物合成中，大多數miRNA基因被RNA聚合酶II(RNA Pol II)轉錄生成長鏈的初級miRNA轉錄物(pri-miRNA)，隨后被加帽聚腺苷酸化并剪接產生pre-miRNA。另有一些miRNA也被RNA酶III(Pol III)轉錄。然后核糖核酸酶Ⅲ(RNase-Ⅲ)的DROSHA瞬間將pri-miRNA中間體切割成包含約70-90個核苷酸的莖環狀pre-miRNA。緊接著由Ran-GTP 依賴性核轉運受體 Exportin5將pre-miRNA運送至細胞質，并由細胞質中Dicer酶進一步處理以產生成熟的miRNA，其長度約為22個核苷酸。成熟的miRNA與Argonaute家族蛋白(AGO)結合形成RNA誘導沉默復合物(RISC)，RISC通過不完全堿基配對使mRNA的3-UTR與miRNA的“種子”區域特異性結合，最后增強mRNA翻轉和/或轉錄抑制。

miRNA表達受到組織特異性和發育階段異性控制。大多數miRNA基因轉錄是由RNA Pol II介導的，他們的啟動子在蛋白質基因編碼中被認為具有序列特征和轉錄調控機制。事實上，高通量測序和生物信息學方法已經揭示，miRNA基因近端上游區域具有TATA盒、啟動子元素、TFIIB識別元素(TFIIB recognition element，BRE)和大量轉錄因子結合基序。此外，最近的研究已經預測miRNA啟動子區域接近轉錄起始位點，暗示表觀遺傳機制，如DNA甲基化和組蛋白修飾對miRNA表達調控的作用。為了更好地理解miRNA基因的多樣性、功能和生物合成，需要關于替代、剪接啟動子和miRNA基因加工的更詳細信息。

2. microRNA-33

位于甾醇調節元件結合蛋白(SREBP)中的內含子miR-33有助于維持體內膽固醇平衡，影響高密度脂蛋白(HDL)生命周期，改善脂肪酸代謝和胰島素信號釋放。值得注意的是，人類基因中存在兩類miR-33,一類是存在于染色體22上srebp-2基因內含子16中的miR-33a，另一類存在于染色體17上srebp-1基因內含子17中的miR-33b。然而在小鼠體內只有一類存在與srebp-2基因內含子15中的miR-33，并與人類miR-33a高度保守。盡管miR-33a/b與宿主SREBP基因共同轉錄以及翻譯蛋白，但是完全獨立調節脂代謝。肝臟是脂肪酸氧化和膽固醇生成的重要場所，而且miR-33在肝臟表達量最為顯著，這些表明了肝臟miR-33對調控機體脂代謝具有重要意義。

3. miRNA-33和脂代謝

miR-33能夠直接或者間接影響相關轉運蛋白和催化酶的活性，參與膽固醇運輸、合成和脂肪酸β氧化，在脂代謝過程中發揮關鍵性作用。

3.1 miRNA-33和膽固醇代謝

膽固醇轉運體，ATP結合盒轉運體A1 (ABCA1)促進膽固醇外流至細胞外受體，形成新生的高密度脂蛋白(HDL)顆粒。這個過程是膽固醇逆轉運(RCT)的第一步，多余的膽固醇從外周細胞轉運至肝臟，以便外排到膽汁和糞便中。肝臟ABCA1失活會導致小鼠體內總HDL-c嚴重減少。由于血漿HDL-C水平與心血管疾病呈負相關，因此ABCA1介導的膽固醇流出對于維持膽固醇動態平衡和防止動脈粥樣硬化至關重要。May等，將可能與膽固醇代謝相關的miRNA和已知脂代謝轉錄因子進行基因分析，鑒定出人類SREBP-2內含子16的序列與miR-33相對應序列高度保守。隨后運用熒光素基因轉染技術，表明人類和小鼠ABCA1以及小鼠ABCG1的3-UTR區含有miR-33互補序列。利用編碼miR-33的腺病毒轉染實驗更加確定，人類和小鼠ABCA1和小鼠ABCG1是miR-33真正地靶標基因。最后進行的體外和體內實驗數據結果顯示，miR-33過表達導致膽固醇向Apoa1的運輸減少，說明miR-33過表達降低細胞排出膽固醇的能力。小鼠體內注射miR-33腺病毒導致ABCA1mRNA和蛋白質減少，血漿總膽固醇下降19%。與注射空白腺病毒小鼠相比，HDL-C降低29%。相反的，注射反義寡核苷酸miR-33腺病毒的小鼠體內ABCA1表達和HDL水平顯著增加。這些研究數據強烈表明，miR-33調節細胞內膽固醇外流和脂蛋白代謝的可能機制是抑制ABCA1的表達。Katey等在實驗過程中發現，miR-33和SREBP-2表達由膽固醇負荷協調下調。miR-33水平與膽固醇水平和ABCA1表達呈負相關，與SREBP-2mRNA水平呈正相關。并且通過檢測小鼠組織和各種細胞系中的miR-33表達水平顯示，除巨噬細胞外，miR-33在小鼠和人的肝臟細胞中高度表達，在內皮細胞中表達較少。但是，miR-33在人源性細胞中強烈抑制NPC1蛋白表達，而小鼠中并未有影響。此外，miR-33轉染的人巨噬細胞、肝細胞和內皮細胞中ABCG1同樣沒有影響。保守地分析顯示，小鼠ABCA1和NPC1的3-UTR中預測的miR-33靶位點高度保守，但ABCG1的3-UTR中miR-33的推定位點僅存在于小鼠中。為評估miR-33對人和小鼠ABCA1、ABCG1和NPC1的3-UTR影響，利用熒光素酶報告基因構架技術，鑒定ABCA1和NPC1為miR-33的保守靶標，而ABCG1僅為小鼠中miR-33靶標。內源性miR-33拮抗作用增加了小鼠和肝細胞中ABCA1表達和膽固醇流出至apoA1。在膽固醇過量消耗的條件下，抑制miR-33顯著增加巨噬細胞和肝細胞中膽固醇流出。細胞操作miR-33表達改變巨噬細胞膽固醇流出，這是膽固醇轉運途中過量膽固醇轉運至肝臟的第一步。miR-33體內過表達主要影響ABCA1調控HDL生成階段，導致血漿HDL含量逐漸下降，6天后將至22%。相反，抗miR-33表達小鼠6天后顯示肝ABCA1蛋白增加50%，血漿HDL水平升高25%。因此控制體內miR-33水平可改變ABCA1表達和HDL-c的動員。這些實驗結果表明，在肝臟中的HDL生物發生過程中，miR-33操縱ABCA1對循環HDL水平影響；在細胞膽固醇流出過程中，miR-33調節HDL和apoA1通過這一途徑將過量膽固醇轉移回肝臟進行排泄。Najaf等在研究SREBP基因調控期間發現，成熟形式的miR-33a/b與所檢測的人和小鼠組織中的SREBP基因共同表達。利用siRNA轉染技術，清楚地表明ABCA1表達被過量的miR-33抑制，特別是在小鼠J774巨噬細胞和人IMR-90成纖細胞中，當細胞系引入抗miR-33時ABCA1的水平顯著增加。這些數據表明，ABCA1蛋白的表達受到miR-33調控。而這種調控是miR-33通過靶向ABCA1基因的3-UTR翻譯抑制或mRNA降解實現。miR-33轉錄后抑制ABCA1導致巨噬細胞內膽固醇保留，調控膽固醇轉錄；而LAN-miR-33a反義處理的小鼠體內血漿HDL-c濃度明顯增加。總之，此項研究表明miR-33對ABCA1進行轉錄后控制，對膽固醇運輸和HDL合成具有重要影響。綜上研究及其他獨立研究證實，miR-33通過翻譯抑制ABCA1、ABCG1和NPC1的表達協調控制細胞膽固醇流出，影響膽固醇反轉運至肝臟的轉運途徑，并通過ABCA1調節體內HDL水平，增加血漿中HDL-c含量。

最新研究普遍認為，內源性的miR-33抑制是治療動脈粥樣硬化的可行性手段。Katey等評估動脈粥樣硬化風險時發現，經過4周miR-33抑制處理的小鼠顯示，循環HDL水平升高，細胞膽固醇逆向轉運增加，血漿、肝臟和糞便膽固醇含量升高；并且粥樣硬化斑塊大小和脂質含量減少，炎癥基因表達降低，動脈粥樣硬化逐漸消退。miR-33缺失的小鼠體內ABCA1和ABCG1蛋白增加，巨噬細胞膽固醇外流加大，血漿中HDL-c含量顯著升高，有效阻止動脈粥樣硬化的發展。

3.2 miRNA-33和脂肪酸代謝

脂肪酸β氧化是脂代謝過程中的關鍵步驟，促使脂肪降解成水、二氧化碳并釋放能量的過程。在對miR-33參與膽固醇代謝研究過程中驚奇的發現miR-33同樣參與脂肪酸氧化。Lswblie等，在研究miR-33對膽固醇代謝影響時注意到， miR-33抑制脂肪酸氧化蛋白HADHB和CPT1A表達水平，似乎能夠抑制脂肪酸的氧化。而且miR-33過表達減少了線粒體20%的β氧化，TCL分析細胞提取物時，細胞內游離脂肪酸水平和膽固醇顯著增加。Alberot等在研究時證實了，miR-33參與調節脂肪酸代謝的基因。使用Pathway Studio 7軟件進行基因本體和生物學關聯分析，預測了miR-33參與脂肪酸β氧化的目標基因，包括CROT，CPT1A，HADHB和AMPKα。miR-33b顯著抑制熒光素酶構建體CROT，CPT1A，HADHB和AMPKα的3-UTR活性以及mRNA表達。相反，表達抗miR-33b的小鼠表現出CROT，CPT1A，HADHB和AMPKα表達適度增加，盡管沒有統計學意義。評估miR-33對脂肪酸β氧化的影響顯示，miR-33b過表達顯著降低Huh7細胞中的脂肪酸β氧化，積累更多甘油三酯。相反，抑制內源性miR-33表達增加脂肪酸β氧化速率。類似地，過度表達的miR-33在果蠅饑餓時累積了更多甘油三酯，表明miR-33從果蠅到人類都能夠調控脂肪酸氧化。另有研究表明， miR-33缺陷癥增加了肝臟和脂肪組織中的SREBP-1水平，脂肪酸合成和脂肪酸積累。在飲食誘導的肥胖小鼠模型中證明，miR-33治療性沉默促進全身氧化代謝。

4.低氧訓練對脂代謝的調節

已經證實，低氧訓練可以有效改善脂代謝，減輕體重。低氧環境下的耐力運動上調脂肪酸β氧化關鍵酶CPT1的mRNA表達，改善營養性肥胖大鼠骨骼肌脂肪代謝。現階段更多的關注點是低氧訓練誘導miRNA調控脂代謝相關基因的研究。朱磊[5]等研究表明，低氧訓練誘導miR-27和miR-122表達下調，PPARγ 和 PPARβ表達上調，進而影響CPT1、FAS、ACC、CYP7A1、CD36、SREBP1基因表達促進膽固醇代謝、HDL-c轉運和脂肪酸氧化。并且該項目組尚未發表的研究證明，低氧訓練顯著降低了肝臟miR-33表達，但遺憾的是未對miR-33在低氧訓練調節脂代謝中的調控進一步研究。

5.結論與展望

miR-33是脂代謝的重要調控因子，通過調控脂代謝相關基因表達促進膽固醇流出、HDL-c濃度以及脂肪酸β氧化，影響機體脂代謝水平。低氧訓練刺激miRNA表達水平的改變調控脂代謝相關基因參與脂代謝。但目前關于低氧訓練對miR-33表達水平的研究尚未有發表的數據，以及低氧訓練調控脂代謝是否是誘導miR-33表達水平的改變導致尚未研究。因此，低氧訓練干預miR-33水平表達調節脂代謝，不僅豐富了脂代謝miRNA分子學機制，而且為運動減脂降重和動脈粥樣硬化治療提供更多科學支持。