高危型HPV DNA整合致宮頸癌的機制及檢測進展

梁 銀，張守桃

（右江民族醫學院，廣西 百色 533000）

宮頸癌指的是發生在宮頸部與子宮頸陰道的一種惡性腫瘤，屬常見婦科腫瘤，發生率僅次于乳腺癌。在近30年，宮頸癌發病率每年上升0.6%，全世界每年有20萬人因宮頸癌死亡，國內每年將近5萬人因為宮頸癌而死。根據病理學描述性的診斷方法把宮頸癌前病變劃分成高度鱗狀上皮內病變（HSIL）與宮頸癌前病變分為低度鱗狀上皮內病變（LSIL），也就是浸潤性宮頸癌（ICC）、宮頸上皮內瘤變（CIN）與宮頸原位癌等。

1 HPV的整合位點

通常病毒整合的位置經常會隨機產生，傾向E1、E2、E4、E5區，上述區域區域被側翼宿主細胞中DNA所中斷。魏文斐[1]等人經收集數個國內外的研究，得出一共有400次整合的事件。梁潔瓊[2]等人于49個宮頸癌的樣本中找出117個獨立的整合位點，這些整合位點橫跨整個病毒的基因組。通常情況下，病毒整合發生在人類基因組內含子以及編碼基因的密集區域，例如：轉錄活性區、致癌基因以及普通脆性位點。高危型HPV DNA一般整合至染色體之中，只有部分會整合至線粒體上，除了9、18、22號染色體以外，其他都有整合的位點。

2 HPV整合可能致癌機制

2.1 宿主的染色體異位與重排

病毒基因的整合會致使宿主染色體出現變化，主要包含非染色質損害、染色體易位與缺失，一直到染色體發生重拍。高冬梅[3]等人研究中指出，將近33%整合位點出現基因的重排，HPV DNA病毒整合與基因組重排間有著高度的相關性。在宮頸癌的細胞系之中，HPV DNA整合在細胞核中的染色體上，會使得E6、E7的基因出現過度表達，引起中心體出現異常的擴增，對細胞周期的有絲分裂保真度進行破壞，導致非整倍體與染色體異常風險加大，屬于結構染色體的不穩定性與DNA破壞主要源頭。如果發生染色體易位，會使得基因發生斷裂，原癌的基因和其他基因會重新結合成融合基因，引起過表達，導致抑癌基因的功能受到影響。

2.2 致癌基因的激活以及抑癌基因的失活

癌癥發展與發生是各類遺傳學功能與結構改變后，出現致癌基因的激活以及抑癌基因的失活所致。pRb與p53抑癌基因能夠對細胞周期進行調節，在E2F的轉錄因子作用下，可以激活pRb，對細胞凋亡進行調節。HPV16中E7與E6產物分別會和pRb、p53結合，然后生成相應的復合體，從pRb-E2F的復合體中E2F會解離為游離態，降解p53以及pRb，導致細胞周期的調節失控，致使細胞停滯在G1期進入到無限的增殖。E6的癌蛋白也可以對c-myc的基因表達進行調節，富含GC區SP1結合位點與cis元素myc基因過表達聯合誘導hTERT上調基因表達，對細胞的增殖能力與染色體穩定性產生破壞，導致角質細胞永生化，所以端粒酶既是一個篩選癌癥的標志物，又是癌癥治療的靶點。c-myc的基因主要處在染色體8q24.1的位置，經過識別與結合靶序列之中CACGTG的核心序列，可以使得轉錄增強或是激活靶基因，經順式作用可以將生長抑制基因對于細胞的無限增殖能力抑制解除，使得細胞永生化，并且會在HPV16/18中出現高度表達，能夠當作宮頸癌的診斷以及預后治療評估指標。

3 分析高危型HPV DNA整合狀態檢測的方法

3.1 分析DIPS-PCR的技術

連接介導（ligation-mediated）的PCR技術能夠對整合乳頭瘤的病毒序列進行檢測，用在HPV永生化角質細胞系的基因組病毒于擴增HPV相關宮頸癌細胞系細胞內的連接體，與測序方法相結合，能夠對染色體進行檢測，能夠用作病毒早期的整合階段檢測方式。

3.2 分析MLPA的技術

多重連接依賴式探針擴增（MLPA）是在PCR、雜交與連接基礎上，于單一反應管內對四十個不同核苷酸靶序列拷貝數變化進行同時檢測，定位定量分析待測核苷酸的一種新技術。主要優勢是操作比較簡單、高通量、重復性好、靈敏度高于特異性高，在染色體的數目異常檢測中比較常用，可以用于甲基化、基因片段的缺失與重排中檢測。孫曉娟[4]等人通過MLPA技術對HPV16/18病毒載量與生理狀態進行同時檢測，研究結果得出MLPA的技術有著較高的敏感性。然而，因為其擴增為待測的探針，不屬于靶序列，因此不可以用在染色體的易位檢測與單個細胞的核苷酸檢測中。

3.3 分析APOT的方法

乳頭瘤病毒致癌基因的轉錄子擴增法（APOT）方法，主要把mRNA的轉錄體當作基礎，可以對游離體起源病毒轉錄體以及整合起源融合轉錄體進行識別，對RNA實施測序、逆轉錄以及PCR的擴增，對HPV中游離轉錄體進行分析，以便對病毒生理的狀態進行鑒定。APOT的技術既可以對病毒的生理狀態進行鑒定，又可以對E6與E7的致癌基因病毒整合具體位點與表達水平進行深入研究，相較于實時定量的PCR技術，其敏感度比較該，然而這種技術只可以對短RNA的轉錄體進行檢測，細胞中需要具備游離的轉錄體才可以擴增，其應用范圍比較狹窄。

3.4 測序技術與雜交捕獲法

雜交捕獲方法（HC）主要是按照高危型DNA的全基因組文庫來設計捕獲的探針，在DNA文庫與捕獲探針雜交以后，通過鏈霉素親、生物素吸附素磁珠吸，沒有捕獲DNA被洗脫，并且洗脫DNA中如果存在整合位點，會繼續實施測序與PCR擴增，獲得病毒整合的染色體圖譜。H屬于唯一獲得FDA批準分型檢測HPV方法，能夠對13種的高危型HPV進行檢測，結合測序方法，可以檢測整合位點與分型，是現階段HPV檢測的一種較好方式。朱義保[5]等人應用這種技術一共發現110多個整合位點，相較于DIPS-PCR的技術，其敏感度比較高。但是因為該技術花費比較高，對于設備要求相對較高，導致基層普及的難度比較大。

4 結 論

總之，HPV疫苗包含醫療性與預防性的疫苗，其中預防性的疫苗把L1、L2當作靶抗原，可以在細胞表面組裝為病毒樣顆粒（VLPs），類似于天然病毒的顆粒結構，免疫原性比較高，可以引起棘突特異性局部免疫與抗體的反應，避免機體受到HPV的感染。因此，在臨床上，經過準確篩查HPV，能夠給臨床治療與預后提供保障。

[1] 魏文斐,蘇桂棟,吳蘭芳.宮頸癌與癌前病變組織中HPV-16的整合感染狀態[J].南方醫科大學學報,2015,23(1):47-50.

[2] 梁潔瓊,趙 敏.高危型人乳頭瘤病毒整合態與宮頸上皮內瘤變及宮頸癌關系的探討[J].中國藥物與臨床,2014,14(4):431-433.

[3] 高冬梅,龍 梅,張 璐.新疆維吾爾族宮頸癌組織中 HPV-DNA 表達及存在狀態的研究[J].新疆醫科大學學報,2014,11(7):837-840.

[4] 孫曉娟,王 健.人乳頭瘤病毒16的整合作用在不同宮頸病變組織中的表達及意義[J].中國綜合臨床,2017,33(1):18-21.

[5] 朱義保,謝 彤,楊亮亮.人乳頭瘤病毒HPV16整合與宮頸病變程度的研究[J].實驗與檢驗醫學,2015,21(4):395-398.