面向臨床應用的光聲成像技術

林日強，冷吉，陳敬欽，劉成波，龔小競，宋亮

中國科學院深圳先進技術研究院 生物醫學光學與分子影像研究室，廣東 深圳 518060

引言

光聲成像主要基于光聲效應，即當物體被脈沖激光照射后，會吸收光能并將部分能量轉化為熱能，進而引起樣品的瞬時熱膨脹和后續的高頻振動，這種高頻振蕩的超聲波即光聲信號，用超聲換能器探測該信號并通過計算機重建成像[1]。早在1880年，Bell實驗室就發現了光聲現象，但直到二十世紀60～70年代，光聲效應才與現代激光技術、超聲探測技術、微弱信號放大技術相結合而開始迅速發展。二十世紀90年代，光聲效應被引入生物組織成像領域，后又經過10余年的努力，光聲成像技術在系統構成、圖像重建、功能成像等各個方面均獲得了巨大的發展，并顯現出其在臨床醫學和基礎醫學研究方面的巨大應用潛力。

生物組織的光聲成像，通常是經過光吸收→激發光聲信號→超聲波檢測→圖像重建等過程，其原理見圖1。在激發光照參數不變的情況下，光聲信號的強度、頻譜與生物體的光學特性（主要是光吸收特性）緊密相關。而不同的組織有不同的光吸收特性，因此光聲成像可以對組織中特定成分進行高對比的結構成像。進一步，結合光聲光譜技術，即在多個波長進行光聲測量，可以定量地分析各種組織成分的變化，精細地反映極其微小的組織病變及血紅蛋白濃度、血氧濃度、氧代謝率等一系列重要的生理參數，實現功能成像[1]。

圖1 光聲成像原理圖

傳統的生物醫學光學成像，如光學相干層析、共聚焦、多光子等，可實現高分辨、高對比的成像。但由于組織對光的強烈散射作用，其成像深度往往局限在1～2 mm。光學擴散層析通過對光子運動軌跡的“追蹤”，可實現厘米級深度成像。但同樣由于組織對光的強烈散射作用，其追蹤過程是針對大量光子的統計學計算，所以其分辨率僅為數毫米。醫學超聲成像可以獲得較大的成像深度（數厘米）和較高的分辨率（數百微米），但由于成像原理是基于聲阻抗不同的對比機制，使其對早期病變成像的對比度要遠低于光學成像方式。光聲成像克服了現有純光學和純超聲成像的局限性，其對比度源于光學吸收差異，分辨率源于光聲發射階段的超聲波探測。由于超聲波在生物組織中的散射比光學散射低3個數量級，因此光聲成像在擴射光子能夠到達的區域，成像分辨率和最大成像深度均可以隨著超聲頻率變化而變化[2]。綜上，光聲成像技術結合了超聲成像的大深度、高分辨特點，同時又具備光學成像的高對比度，是一種非常有應用潛力的新興成像技術。

由于具備在大穿透深度與高分辨成像之間靈活調節切換的能力，使得光聲成像技術可以根據不同的應用目的，采用不同的成像方式，以獲得與應用更為匹配的優質圖像。本文中，我們將主要介紹3種常見的光聲成像方式：光聲顯微成像技術、光聲計算層析成像技術、光聲內窺成像技術。光聲顯微成像技術和光聲內窺技術主要目標是在毫米級的成像深度上實現微米級的分辨率。而光聲計算層析技術的探測深度和分辨率可在較大范圍內變化，既可以實現顯微成像，也可以實現大深度的成像。

光聲成像技術作為一種正在迅速發展的新型成像技術，憑借其靈活的成像方式、優質的成像能力、高度的生物安全性，正越來越多地受到生物醫學成像領域研究人員的密切關注。近年來光聲成像已被證明在眾多生物醫學領域有重要的應用價值，如腫瘤血管新生成像[3]、血紅蛋白和血氧濃度成像[4]、心腦血管易損斑塊成像[5]、乳腺癌診斷[6]等。本文中，我們結合本研究團隊的主要研究工作，重點介紹與臨床應用緊密聯系的微血管成像、血管介入成像、消化道內窺成像、前哨淋巴結成像的光聲技術的最新進展。

1 微血管成像

微血管的尺度在10 μm左右，需要采用光學分辨率光聲顯微成像系統（Optical-Resolution Photoacoustic Microscopy，OR-PAM）進行觀察。OR-PAM是光聲成像的一種主要形式，由于其橫向分辨率達到光學聚焦量級（微米或者亞微米級），因此稱為“光學”分辨率光聲顯微系統。該系統使用聚焦后的激光光束進行光聲信號的激發，并將超聲接收焦點與光激發焦點調節至共聚焦狀態以實現最高的接收效率。

本研究團隊搭建的OR-PAM系統結構圖（圖2）中[7]，納秒脈沖激發光由532 nm波長的釔鋁石榴石晶體（Nd：YAG）固體激光器輸出；經小孔整形與透鏡聚焦后，再經光纖耦合器，耦合到單模光纖中；光纖出射光再經過兩個相同的物鏡進行準直和聚焦，最后照射到組織樣本上為直徑大約5 μm的光斑。產生的光聲信號用水進行耦合后再經過組合棱鏡的兩次全反射后被其上方的高頻超聲換能器接收，該棱鏡中間夾層灌注有硅酮油，用于透射激光反射超聲，聲透鏡則附于棱鏡的下方用于增強接收信號的靈敏度；接收到的光聲信號放大后由高速數據采集卡進行采集，經計算機用MATLAB程序對采集的數據進行希爾伯特變換以及濾波處理后成像。三維位移平臺用于移動成像探頭進行機械掃描，獲得三維數據[6-7]。

圖2 OR-PAM系統結構圖[7]

利用OR-PAM，我們成功實現了活體狀態下對小鼠耳部血管網絡的無創、無標記的光聲成像（圖3a）[7]。體成像分辨率達到5 μm，實現了對單個紅細胞成像。通過自制夾具，我們還對小鼠背部乳腺癌腫瘤（4T1）進行了無標記的連續觀察（圖3b～3d）[8]。通過不同波長的激光進行激發，獲得了血紅蛋白在不同波長下的光聲信號，結合氧合血紅蛋白和脫氧血紅蛋白的光譜差異，可從中提取出血氧飽和度信息。在今后研究中，需要提高該系統的光穿透深度以及光聲信號探測效率，以獲得更高深度的成像。利用該技術，可實現腫瘤周邊微血管生成過程的無創精細觀察，結合藥物對小動物腫瘤模型的長期觀察，有望為腫瘤病理學研究和臨床診斷提供全新的工具。

2 血管介入成像

血管內光聲成像（Intravascular Photoacoustic Imaging，IVPA）是一種新型檢測血管內易損斑塊的成像技術。它利用介入成像導管，深入到病變血管處進行成像。由于不同組織的吸收特性各不相同，因此IVPA可利用組織自身的光吸收對比和光聲光譜方法，高敏銳的檢測斑塊的化學組分（如脂質核）。與傳統的血管內超聲成像（Intravascular Ultrasound，IVUS）和血管內光學相干層析成像只能夠對血管內壁的結構和形態成像相比，血管內光聲成像能夠針對生物組織的成分差異或分子特異性進行功能成像。

圖3 OR-PAM系統在體成像的部分代表成果[7]

本研究團隊所設計的高速血管內光聲超聲雙模成像系統，見圖4a[9]。

激發源為重復頻率為1 kHz的納秒級脈沖光學參量振蕩激光器（Optical Parameter Oscillator，OPO），激發光經過光闌光束整形和中性密度濾波片衰減后，再由透鏡匯聚到多模光纖內，并經光纖導入由光纖、自聚焦透鏡、棱鏡與超聲換能器構成的成像導管內（圖4b）。光纖出射光經自聚焦透鏡會聚、棱鏡反射，照射在血管內壁，激發出的光聲信號被超聲換能器接收，獲得血管壁的光聲圖像；同時超聲換能器還進行超聲的發射和接收，獲得血管壁的超聲圖像。成像導管在旋轉—平移掃描平臺的帶動下完成“螺旋式”掃描，所采集的數據通過高速數據采集卡傳遞到計算機，利用MATLAB軟件對其進行希爾伯特變換和極坐標變換，最終實現三維的光聲/超聲雙模成像。

利用上述搭建的IVPA系統（圖4c）以及我們設計制作的外徑為0.9 mm的光聲/超聲雙模成像導管進行了成像實驗，獲取了由黃油制作的脂質仿體在波長為1185 nm、1195 nm、1210 nm、1225 nm和1235 nm下的光聲圖像，獲得了光聲光譜信息（圖5d）[9]。由圖5d可以看出，將測得的光聲光譜與脂質的吸收譜比對，二者非常接近，并且利用二者進行互相關計算，可對脂質成分進行鑒別，進而獲得脂質成份的分布圖（圖5e）。該技術可用于對易損斑塊中的脂質核成分進行檢測，為斑塊易損性的診斷提供功能信息，有望成為臨床新一代的成像工具，為醫生提供更詳盡的診斷信息。在今后的系統的改進中，應該提高光學耦合效率，以提高脂質信號的探測靈敏度。

圖4 高速血管內成像系統圖[9]

圖5 利用IPVA獲取的光聲光譜圖像[9]

此外，利用該系統，我們對離體的兔子血管內植入的心臟支架（圖6a）進行了成像[9]，成像速度可以到達每秒5幀。我們利用連續采集的多個超聲和光聲B-Scan圖像進行了三維重建（圖6b～c），可以看出IVPA相對IVUS具有更高的對比度，更有利于對支架的放置情況進行評估。因此亦可以利用該成像系統引導心臟支架介入手術以及監測心臟支架的植入情況。

3 消化道內窺成像

現階段，對消化道疾病的常規診斷仍然依賴于醫用內窺鏡。醫用內窺鏡不僅能及時發現病灶位置，為醫生提供病灶區域的圖像，還能引導手術，對發病位置進行監控、采樣、給藥、切除等操作。但是目前臨床內窺鏡仍然具有一定局限性。白光和熒光類的內窺成像技術受限于傳統光學成像技術的穿透深度，大多只能對消化道的表皮成像，無法觀察到表皮以下的組織情況，難以判斷腫瘤浸潤深度，在一定程度上局限了其疾病診斷能力。超聲成像的不足在于其圖像對比度有限，針對某一種特定成分進行成像的特異性較差[10]。

圖6 健康兔子血管植入心臟支架圖像[9]

基于此，本研究團隊在血管內光聲成像技術的基礎上發展了消化道光聲/超聲雙模內窺鏡，并針對特定成像對象和成像范圍，對成像探頭進行了全新設計。最終，我們實現了可兼容臨床內窺鏡活檢通道的成像探頭（外徑為2.5 mm）。利用該探頭，我們在國內首次實現了小動物的活體內窺光聲/超聲雙模同位成像（圖7）[11]。該技術既能對消化道淺表病灶的血管形態、血氧飽和度等進行功能成像，又能探測腫瘤浸潤深度，在不同模態成像下獲取多參量多尺度的信息。在接下來的研究中，我們將嘗試將本系統與現有消化內鏡技術融合，并逐步提高系統分辨率[12]與成像速度[13]，初步建立基于光聲內窺鏡的消化道早癌多模態診斷體系和標準。利用該技術有望更早更快發現消化道腫瘤，為消化道的臨床診斷提供方法上的革新。

圖7 大鼠直腸在體光聲/超聲雙模成像[11]

4 前哨淋巴結成像

傳統的乳腺癌前哨淋巴結檢測中，通常采用追蹤放射性標記物并注射染料的方式定位前哨淋巴結，再將定位后的前哨淋巴結取出，進行病理檢測。此種方法可引起嚴重的并發癥，并且假陰性率高。而基于超聲的針刺型活檢雖然是微創手術，一般不會造成并發癥，但是由于超聲技術的低對比度，難以精準定位前哨淋巴結的位置。光聲成像因其具有高對比度優勢，能夠大幅提升針刺型活檢的有效性，在降低風險的同時，提高了前哨淋巴結檢測的準確度[14-15]。

針對這一應用，本研究團隊開發了基于手持式超聲陣列探頭的光聲實時成像系統，主要包含：128通道數據采集裝置，OPO納秒脈沖激光器，光纖（或光纖束），手持式光聲/超聲探頭，以及光路等附加部件系統，系統見圖8[16]。

圖8 手持式乳腺癌前哨淋巴結成像系統[16]

仿體實驗結果表明，系統分辨率可達250 μm，成像速率為每秒20幀，能夠實時成像。利用該系統，我們通過向大鼠前爪注射吲哚菁綠（Indocyanine Green，ICG）小分子光聲成像對比劑，成功實現了大鼠前哨淋巴結的定位成像（圖9）。該技術展示了光聲成像技術在微創、高效檢測前哨淋巴結中的重要應用潛力。在未來研究中，我們將繼續致力于改進算法與系統結構，以提高系統的成像速度以及成像靈敏度[17-18]，以期望其在乳腺癌早期診斷中發揮重要作用。

圖9 手持式光聲成像系統用于大鼠前哨淋巴結成像結果

5 總結

綜上所述，光聲成像技術既可以高分辨、高對比的對組織進行特異性結構成像，也可對目標組織中的特定成分進行鑒別，還可結合分子探針進行靶向目標成像。因此，光聲成像技術作為一種兼具高對比度結構成像與高敏銳功能成像能力的新型成像技術，正在臨床腫瘤、心腦血管疾病早期診斷等方面展現出巨大應用潛力[19-21]。推動光聲成像技術的進一步臨床轉化與產業化，具有重大經濟價值和社會意義。

[1] Wang LV,Hu S.Photoacoustic tomography: in vivo imaging from organelles to organs[J].Science,2012,335(6075),1458-1462.

[2] 汪立宏,吳新一.生物醫學光學：原理和成像[M].合肥:中國科學技術大學出版社,2017.1.

[3] Lao YQ,Xing D,Yang SH,et al.Noninvasive photoacoustic imaging of the developing vasculature during early tumor growth[J].Phys Med Biol,2008,53:4203-4212.

[4] Zhang HF,Maslov K,Sivaramakrishnan M,et al.Imaging of hemoglobin oxygen saturation variations in single vessels in vivo using photoacoustic microscopy[J].Appl Phys Lett,2007,90(5):1555.

[5] Wang B,Emelianov S.Thermal intravascular photoacoustic imaging[J].Biomed Opt Express,2011,2(11):3072-3078.

[6] Ermilov SA,Khamapirad T,Conjusteau A,et al.Laser optoacoustic imaging system for detection of breast cancer[J].J Biomed Opt,2009,14(2):024007.

[7] Chen J,Lin R,Wang H,et al.Blind-deconvolution opticalresolution photoacoustic microscopy in vivo[J].Opt Express,2013,21(6):7316.

[8] Lin R,Chen J,Wang H,et al.Longitudinal label-free opticalresolution photoacoustic microscopy of tumor angiogenesis in vivo[J].Quant Imag Med Surg,2015,5(1):23-29.

[9] Li Y,Gong X,Liu C,et al.High-speed intravascular spectroscopic photoacoustic imaging at 1000 A-lines per second with a 0.9 mm diameter catheter[J].J Biomed Opt,2015,20(6):065006.

[10] Yang JM,Favazza C,Chen R,et al.Simultaneous functional photoacoustic and ultrasonic endoscopy of internal organs in vivo[J].Nat Med,2012,18(8):1297-1302.

[11] Lin R,Li Y,Chen J,et al.Full field-of-view photoacoustic endoscopy in vivo[J].P SPIE, 2017,64.

[12] Yang JM,Li C,Chen R,et al.Optical-resolution photoacoustic endomicroscopy in vivo[J].Biomed Opt Express,2015,6(3):918-932.

[13] Wu M,Springeling G,Lovrak M,et al.Real-time volumetric lipid imaging in vivo by intravascular photoacoustics at 20 frames per second[J].Biomed Opt Express,2017,8(2):943.

[14] Manohar S,Vaartjes SE,Hespen JCGV,et al.Initial results of in vivo non-invasive cancer imaging in the human breast using near-infrared photoacoustics[J].Opt Express,2007,15(19):12277.

[15] Kim C,Erpelding TN,Maslov K,et al.Handheld array-based photoacoustic probe for guiding needle biopsy of sentinel lymph nodes[J].J Biomed Opt,2015,15(4):046010.

[16] Li M,Liu C.A novel compact linear-array based photoacoustic handheld probe towards clinical translation for sentinel lymph node mapping[J].ICBIH,2015.

[17] Ermilov SA,Khamapirad T,Conjusteau A,et al.Laser optoacoustic imaging system for detection of breast cancer[J].J Biomed Opt,2009,14(2):024007.

[18] Wang Y,Erpelding TN,Jankovic L,et al.In vivo threedimensional photoacoustic imaging based on a clinical matrix array ultrasound probe[J].J Biomed Opt,2012,17(6):061208.

[19] Knieling F,Neufert C,Hartmann A,et al.Multispectral optoacoustic tomography for assessment of crohn’s disease activity[J].N Engl J Med,2017,376(13):1292.

[20] Stoffels I,Morscher S,Helfrich I,et al.Metastatic status of sentinel lymph nodes in melanoma determined noninvasively with multispectral optoacoustic imaging[J].Sci Transl Med,2015,7(317):ra199.

[21] Taruttis A,Timmermans A,Wouters P,et al.Optoacoustic imaging of human vasculature: feasibility by using a handheld probe[J].Radiology,2016,281(1):256-263.