中國134例黑色素瘤患者P16INK4a、CDK4和CCND1基因突變及其臨床意義

吳曉雯，閆君雅，代 杰，孔 燕，郭 軍

(北京大學腫瘤醫院 腎癌黑色素瘤內科，北京 100142)

近年來腫瘤發病率與病死率不斷增加，已經成為中國人群死亡率最高的疾病[1]。黑色素瘤在我國每年新發病人數超過二萬人，屬發病率不高但致死率極高的惡性腫瘤[2]。盡管黑色素瘤靶向藥物進展迅速，但仍有多數患者不能從中獲益。目前臨床已有明確療效的藥物靶點主要是BRAF基因和KIT基因[3- 4]，但兩者的突變率在中國黑色素瘤患者中僅占50%[5- 6]。而P16INK4a-cyclinD1-CDK4信號通路異常在黑色素瘤中可高達22%～78%[7]，提示該通路可能成為黑色素瘤靶向治療新的突破點。由于黑色素瘤基因突變存在人種差異，中國黑色素瘤患者P16INK4a、CDK4、CCND1基因突變情況尚缺乏證據。本研究擬通過檢測中國黑色素瘤患者的P16INK4a、CDK4、CCND1基因突變情況，探索其與臨床預后的關系，為探尋中國黑色素瘤患者的個體化靶向治療策略提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：收集2010年1月至2014年12月在北京腫瘤醫院腎癌黑色素瘤內科接受診治的134例黑色素瘤患者的腫瘤組織石蠟包埋標本及外周血淋巴細胞。所有石蠟標本均經病理組織學(HE染色，免疫組化)明確診斷。隨訪收集相關臨床資料，包括年齡、性別、初診時間、亞型、TNM分期、腫瘤厚度、潰瘍和生存情況。所有患者均簽署了本研究的知情同意書。

1.1.2 主要試劑儀器：DNA提取試劑：QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (德國QIAGEN GmbH公司)；Universal Genomic DNA Kit和PCR相關試劑：2×GoldStar Best MasterMix(北京康為世紀生物科技有限公司)；BSA及引物(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤組織石蠟標本全基因組DNA提?。悍蛛x石蠟包埋組織中的腫瘤細胞，按照QIAamp DNA FFPE Tissue Kit說明書提取基因組DNA，將DNA置于-20 ℃保存備用。

1.2.2 淋巴細胞DNA提取及基因擴增：分離患者外周血淋巴細胞，使用試劑盒提取淋巴細胞DNA，-20 ℃保存備用。

1.2.3 巢式PCR：應用巢式PCR技術擴增CDK4基因2號外顯子，P16INK4a基因 1α、2、3號外顯子，CCND1基因4、5號外顯子，滅菌超純水代替模板DNA作為陰性對照。

1.2.4P16INK4a、CDK4、CCND1基因測序：將PCR產物送至北京天一輝遠生物科技有限公司進行基因純化和Sanger測序。使用Chromas和Gene Runner軟件對測序結果進行判讀。

1.2.5P16INK4a、CDK4、CCND1基因突變風險預測：使用Uniprot 數據庫(http://www.uniprot.org)和Polyphen(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml)對突變進行功能預測。

1.3 統計學分析

應用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，采用雙側概率檢驗法。連續變量的均值比較采用成組t檢驗，多樣本率的比較采用Pearson卡方、連續校正卡方檢驗、Kruskal-Wallis秩和檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法、COX回歸分析進行單因素和多因素分析。

2 結果

2.1 患者基本信息

研究共納入黑色素瘤患者134例，其中男性62例(46.3%)，女性72例(53.7%)。年齡分布為(55.1±12.7)歲，腫瘤平均厚度為5.42 mm，總體潰瘍發生率63.9%(78/122)。中國黑色素瘤患者各病理亞型比例為：肢端型27.6%(37/134)，黏 膜 型 64.2%(86/134)和非肢端皮膚型8.2%(11/134)。

2.2 P16INK4a、CDK4、CCND1基因突變情況

2.2.1P16INK4a基因突變情況：134例黑色素瘤組織標本共檢測到P16INK4a基因錯義突變11例，突變率為8.2% (11/134)，其中肢端型、黏膜型黑色素瘤P16INK4a基因突變率分別為10.8% (4/37 ) , 8.0%(7/87)。經外周血淋巴細胞DNA重復上述測序證實，以上突變均不是遺傳性突變。局灶性黑色素瘤(Ⅰ-Ⅱ期)P16INK4a基因突變頻率為8.7%(4/46)，轉移性黑色素瘤(Ⅲ-Ⅳ期)P16INK4a基因突變頻率為8.0%(7/88)。

P16INK4a的編碼序列覆蓋1α、2、3號外顯子，1α外顯子檢測到2個錯義突變，突變類型為E33A(g98c) 、G45D(g135a), COSMIC數據庫未見報道。2號外顯子檢測到9例錯義突變：其中6例為D74A(a221c)，其余點突變分別為：N71K(c213g)1例，G101R(g301a)1例，A109S(g325t)1例。其中G101R(g301a)，A109S(g325t)為新發現突變，COSMIC數據庫未見報道。3號外顯子未檢測到錯義突變。

肢端型黑色素瘤中發現的P16INK4a基因突變均為2號外顯子D74A(a221c)型突變，突變率為10.8%(4/37 )。黏膜型黑色素瘤中發現的P16INK4a基因突變分布在1α和2號外顯子。經Polyphen數據庫功能預測，81.8%(9/11)的P16INK4a基因突變可能對蛋白質功能造成影響。P16INK4a基因突變類型和分布區域見表1。

2.2.2CDK4基因突變情況：研究僅檢測到1例CDK4基因錯義突變(0.75%), 突變類型為L60R，既往未見報道。經Polyphen數據庫功能預測，此突變為有害突變可能性大(score=1.000, effect: probably damaging)。

2.2.3CCND1基因突變情況：在134例標本未檢測到CCND1基因錯義突變，但4號外顯子發現同義替換SNP位點(rs9344:g723a,P241P)在75.6%(90/119)的樣本中重復出現。

2.3 P16INK4a基因突變與臨床病理特征之間的關系

攜帶P16INK4a基因突變的患者年齡為(54.9±14.9)歲。在臨床分期上，P16INK4a基因突變組患者包括Ⅰ期0例、Ⅱ期4例、Ⅲ期2例、Ⅳ期5例。在病理亞型上，P16INK4a基因突變組包括肢端型4例(36.4%)、黏膜型7例(63.6%)、非肢端皮膚型0例(0%)。P16INK4a基因突變型組潰瘍發生率(45.5%)，P16INK4a基因野生型組潰瘍發生率(65.8%)(表2)。

2.4 P16INK4a基因突變與OS之間的關系

2.4.1 總體生存情況：134例患者中，共有74.6%(100/134)因腫瘤進展死亡，25.4%(34/134)患者失訪?；颊呖傮w預后不佳，中位生存時間28個月(范圍：3～168個月，95%CI：20.6～35.3個月)，1年、3年、5年生存率分別為83.6%、41.6%、24.3%。

2.4.2P16INK4a基因突變與OS：P16INK4a基因突變型患者的中位生存期為14個月(95%CI：9.1～18.9 個月),P16INK4a基因野生型患者的中位生存期為30個月(95%CI：22.3～37.7 個月)，遠高于突變患者，差異有統計學意義 (P< 0.01)(圖1)。處于不同TNM分期的患者的總生存期差異有統計學意義(P<0.001)，P16INK4a基因突變(P<0.05)、TNM分期(P<0.001)是黑色素瘤的獨立預后因素。P16INK4a基因發生錯義突變后不良預后風險提高2.8倍(HR=2.841，95%CI:1.481～5.450)，TNM分期越晚，預后越差(HR=1.734，95%CI:1.351～2.225)。根據統計學預后模型h(t)=0.550*stage+1.081*P16INK4a(突變型=1，野生型=0)將患者進行風險分組，低危組h(t)<2、高危組h(t)≥2患者中位生存期分別為43個月(95%CI：27.7～58.3個月), 21個月(95%CI：16.7～25.3個月)，差異有統計學意義(P<0.001)(圖2)。

表1 134例黑色素瘤患者P16INK4a基因突變類型分析Table 1 P16INK4a mutations indentified in 134 patients with melanoma

Annotation:*the score was calculated by computer and can measure the predicts possible impact of an amino acid substitution on the structure and function of a human protein.

表2 P16INK4a突變與臨床病理參數

annotation:solid line.wild type (WT); dottedline.mutation(Mut)圖1 P16INK4a突變與總生存期分析Fig 1 Overall survival of melanoma patients in relation to P16INK4a mutations

annotation:solid line.low-risk group; dottedline.high-risk group圖2 風險分組與總生存期分析Fig 2 Overall survival of melanoma patients in relation to risk

3 討論

P16INK4a-cyclinD1-CDK4信號通路參與調節細胞周期中G1/S期轉換，該通路異常會引起細胞周期調控失控，在黑色素瘤發生和發展中具有重要作用[8]。國外研究表明黑色素瘤基因突變具有人種差異，而P16INK4a、CDK4和CCND1基因在中國黑色素瘤人群中的突變情況尚無報道。本研究結果顯示中國黑色素瘤患者CDK4基因突變率為0.75%，與COSMIC數據庫報道相近，再次證實該基因在黑色素瘤中較少發生突變，發現的1例CDK4突變類型為L60R(a179c)，為有害突變可能性極大，其他研究中尚未見報道，其功能學有待進一步研究探索。中國黑色素瘤患者CCND1基因錯義突變率為0%，但4號外顯子檢測到高頻SNP位點，功能學意義值得深入探索。中國黑色素瘤患者P16INK4a基因突變率8.2%(11/134)，與白種人黑色素瘤突變率結果相近[9]，低于黑色其中高達81.8%的P16INK4a錯義突變可能會對P16INK4a蛋白功能造成影響，該比例遠高于白種人黑色素瘤人群的相關研究[10]，提示中國黑色素瘤患者P16INK4a錯義突變可能在P16INK4a-cyclinD1-CDK4信號通路異常起到重要作用。突變引起的腫瘤細胞功能學改變需要進一步研究證實。

肢端型和黏膜型黑色素瘤是中國黑色素瘤患者的主要亞型[5]，本研究發現，肢端型和黏膜型黑色素瘤患者P16INK4a基因突變率分別為10.8%，8.0%，尚未見報道。肢端型黑色素瘤P16INK4a基因點突變均為2號外顯子D74A(a221c)型突變，突變率高達10.8%，隨著細胞周期抑制劑臨床試驗的開展，P16INK4aD74A 熱點突變可能是肢端型黑色素瘤的潛在治療靶點。

腫瘤分期、厚度和潰瘍是目前已知的影響黑色素瘤預后的因素[11]。本研究發現，P16INK4a基因突變與腫瘤分期、厚度和發生潰瘍無相關性，但卻是影響黑色素瘤患者預后的重要因素。P16INK4a突變型患者的預后較差，對黑色素瘤患者進行P16INK4a基因檢測并對患者進行風險評估，有助于制定合理的治療方案，及時采取干預措施。針對P16INK4a基因突變的功能學研究將有可能為臨床以P16INK4a-cyclinD1-CDK4為靶點的干預策略提供線索。

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