結直腸癌患者循環腫瘤DNA定量KRAS基因突變的檢測

吳兆明，劉 平，余玲玲，王金丹，Nguelemo Mayopa Kevin，駱美辰，施蘇雪，鄭曉群,*

(1.溫州醫科大學； 2.溫州醫科大學附屬第二醫院， 浙江 溫州 325000)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率在國內惡性腫瘤中均排第5位[1]。隨著表皮生長因子受體抑制劑如西妥昔單抗等靶向藥物的出現，結直腸癌患者的治療有效率和總生存時間不斷提高。研究顯示，西妥昔單抗的治療效果與患者KRAS基因型密切相關，只有野生型KRAS基因的患者才能從該藥物的治療中獲益，而突變型的患者則不能[2]。中國結直腸癌患者KRAS基因突變率約占30%～60%[3- 4]，主要為G12D、G12V和G13D突變等。近年來，循環腫瘤DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)等液體活檢材料在臨床腫瘤研究中備受重視[5- 6]。微滴式數字PCR(droplet digital PCR，ddPCR) 技術作為第3代PCR技術因其高度靈敏性而備受臨床診斷領域所矚目[7]。ddPCR能定量檢測含量極低核酸分子[8- 9]，它克服了血漿ctDNA因含量低而不易擴增的難點。因此，本研究以KRAS基因G12D位點研究靶點，構建ddPCR定量檢測血漿KRAS基因突變檢測方法，為結直腸癌患者的早期篩查、預后判斷、指導臨床用藥及腫瘤的轉移與復發監測提供準確和便捷的實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試者選擇選取：2015年3月至2016年4月在溫州醫科大學附屬第二醫院的結直腸癌患者為研究對象。患者經病理組織學確診，同時符合2010 年中國衛生部制定的《結直腸癌診療規范》中的診斷標準。本研究共52例患者，男性29例，女性23例，年齡中位數45歲(35～82歲)。選擇同期正常健康體檢人群為對照組，共80名，男性45名，女性35名，年齡中位數38歲(25～81歲)，對照人員無腫瘤病史、無高血壓、糖尿病及高脂血癥等慢性病，無嚴重器質性心、肝、肺等病史，妊娠期及哺乳期婦女除外。參加此項課題的受試群體均無血緣關系，且經醫院倫理委員會批準，受試者簽訂知情同意書。

1.1.2 試劑：血清/血漿游離DNA提取試劑盒(金麥格生物技術有限公司)；人類組織DNA試劑盒(Qiagen公司)；Bio-RadQX100TMddPCRTM定量試劑盒(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 采集標本和臨床資料：收集4 mL外周血于EDTA-K2抗凝管，1 600×g10 min，16 000×g10 min低溫分離血漿，將血漿置于-80 ℃冰箱冷凍保存。同時，采取結直腸癌患者腫瘤組織標本，置于-80 ℃冰箱冷凍保存。

1.2.2 ddPCR技術檢出限檢測：由上海奕躍生物科技有限公司人工合成124 bp的KRAS基因目的片段克隆于pUC- 57質粒載體，將質粒作為野生型和突變型標準品。將突變型標準品按10倍比稀釋為8.436×105copies/μL到8.436×10-1copies/μL標準品，質粒濃度初始濃度計算公式：(6.02×1023)×10-9(ng/μL)/(DNA length×660)=copies/μL，每個濃度的樣本重復檢測3次，以此評估ddPCR的檢出限。

1.2.3 ddPCR檢測ctDNA的KRAS基因型：按DNA提取試劑盒提取游離DNA，上游引物序列：TG GTCTGTTTTGCTTGGTCAAG，下游引物序列：GCTG TCTACACTCAACTAGCAAGGAA；探針：HEX-GAGC TGGTGGCGT和FAM-GAGCTGATGGCGT；PCR反應體系：2×ddPCR 探針反應混合液12.5 μL，10 μmol/L引物每條各2.25 μL，10 μmol/L探針每條各0.675 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補足至25 μL。野生型與突變型質粒分別作為野生型標準品和突變型標準品，用于陽性及陰性對照，以保證結果的準確性。

1.2.4 Sanger測序檢測腫瘤組織的KRAS基因型：采用DNA試劑盒對新鮮組織樣本進行DNA提取，NanoDrop 2000超微量分光光度計測定樣本DNA含量與純度。15 μL PCR反應體系中包含:7.5 μL 2×Taq Plus Master mix， 0.2 μL上下游引物和2 μL DNA樣本，ddH2O補足至15 μL；PCR反應條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30個循環；72 ℃ 12 min。擴增產物送杭州華大基因公司在ABI3730序列分析儀上進行雙向測序，測序結果采用Chroms軟件進行分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0和Graph Pad PrismV5.0 統計學軟件進行數據分析，人均年齡描述位(中位數，最小值-最大值)，KRAS基因突變檢出率組間比較采用卡方檢驗，KRAS基因G12D突變濃度組間比較采用Mann-Whitney 檢驗。

2 結果

2.1 稀釋實驗評價ddPCR檢測限

ddPCR技術對質粒KRAS基因的檢測限可達8.436 copies/μL，較Taqman熒光定量技術高1個數量級(表1)。

2.2 ddPCR檢測KRAS基因G12D突變率

患者組血漿KRAS基因G12D突變率達26.92%，顯著高于健康對照的8.75%(P<0.05)(圖1)。高度分化腺癌的突變率為77.78%，顯著高于中度和低度分化腺癌的突變率(P<0.05)；淋巴結轉移N2的突變率為46.15%，顯著高于N0和N1(P<0.05)(表2)。

2.3 ddPCR檢測KRAS基因G12D突變濃度

結直腸癌患者組14例KRAS基因G12D突變型攜帶者中血漿突變濃度中位數為81.5 copies/mL(10～2 586 copies/mL)顯著高于健康對照7名攜帶者的16 copies/mL(7.5～23 copies/mL)(P<0.000 1)。患者組淋巴轉移N2患者突變濃度中位數120 copies/mL(12～2 586 copies/mL)顯著高于N1和N0患者(P<0.05)(表2)。

表1 ddPCR技術和Taqman熒光定量技術突變基因檢測限的比較

2.4 結直腸患者血漿ctDNA和腫瘤組織KRAS基因突變檢測結果的比較

52例中16例存在KRAS基因G12D突變，其中血漿樣本檢測出14例存在KRAS基因G12D突變。

blue droplets forKRASgene wild type；green droplets forKRASgene Mutant type；A03.blank group；B03.wild typeKRASgene negative control；C03.mutantKRASgene positive control；D03-H03.sample 1～5；A03.blank group；B03.wild typeKRASgene negative control；C03.mutantKRASgene positive control；D03-H03.sample 1～5

圖1 KRAS基因G12D突變的ddPCR分析結果一維散點圖和微滴結果圖Fig 1 One dimensional scatter plot of ddPCR analysis results and drop result diagram of KRAS gene G12D mutation

且14例血漿和組織標本中的突變一致，以組織樣本KRAS基因Sanger測序結果為金標準， ddPCR檢測血漿ctDNA中KRAS基因G12D突變特異性為87.50%(表3)。

表3 52例結直腸癌患者血漿ctDNA和腫瘤組織KRAS基因G12D突變結果比較

3 討論

表皮生長因子受體抑制劑西妥昔單抗是治療結直腸癌的靶向藥物，它使結直腸癌的治療進入了個體化靶向治療時代，在臨床取得了很好的治療效果。研究顯示，西妥昔單抗治療的有效性受患者下游基因KRAS狀態的影響。只有野生型KRAS基因的患者才能從西妥昔單抗的治療中獲益，而突變型的患者則不能[10- 11]。因此，本文通過建立ddPRC技術定量檢測KRAS基因G12D突變，為臨床用藥提供指導。在52例結直腸癌患者的血漿樣本中共檢出了14例KRAS基因G12D突變，占26.92%，本研究結果與報道[12]的檢測860例中國結直腸癌患者腫瘤組織中16.5%KRAS基因G12D突變結果以及報道[13]的21.49%相一致；進一步分析發現血漿KRAS基因G12D突變率與分化程度和淋巴結轉移等臨床特征相關，血漿KRAS基因G12D突變濃度與淋巴結轉移相關。這可能與腫瘤的局部擴散，淋巴結轉移個數增加而導致腫瘤細胞主動釋放ctDNA增加有關。另外，該技術對質粒KRAS基因的檢測限可達8.436 copies/μL，較Taqman熒光定量技術高1個數量級。同時，結直腸癌患者血漿KRAS基因G12D突變與腫瘤組織突變一致性達87.50%，但由于血漿ctDNA含量較少，可能存在假陰性結果，本研究發現2例血漿ctDNA未檢出G12D突變。正如Sanmamed、Oxnard等[14- 15]相關報道ddPCR技術可應用于ctDNA突變檢測。因此，本項目研究應用ddPCR高敏感、高特異性的技術優勢建立的KRAS基因突變定量檢測方法，以血漿ctDNA為檢測對象，可以實時為結直腸癌患者提供體內腫瘤特異基因改變的信息，并進一步為其以靶向治療為基礎的個體化治療用藥、預后判斷等提供準確和便捷的實驗室依據。

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