姜黃素抑制順鉑誘導(dǎo)人腎小管上皮細胞系HK- 2凋亡

呂文秀，吳文韜，鄭士梅，謝林虎，丁伯平*

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院；2. 皖南醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241000)

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惡性腫瘤已經(jīng)成為當今人類面臨的巨大難題，2013年中國惡性腫瘤發(fā)病率為235/10萬[1]。目前惡性腫瘤尚無有效的治愈方法，只能通過各種治療手段來抑制或減緩癌細胞的增殖。順鉑(cisplatin, DDP)是一種臨床常用的抗癌藥物，用于肝癌等多種實體腫瘤的治療[2]。但是作為治療惡性腫瘤的基礎(chǔ)藥物，順鉑在抗癌的同時具有較強的細胞毒性[3]， 其中最嚴重的就是腎毒性[4]， 嚴重影響了治療效果，限制了該藥的應(yīng)用與推廣。姜黃素(curcumin,CUR)是一種從姜黃根莖中提取得到的具有抑制腫瘤生長、抗動脈硬化與抗感染等多種作用的化合物[5]。目前研究表明凋亡蛋白的激活及表達增加在細胞凋亡中具有介導(dǎo)作用[6]。聯(lián)系抗癌藥物順鉑在治療過程中的腎毒性，順鉑與姜黃素均有抗腫瘤作用，同時姜黃素對腎毒性有一定的抑制作用[7]，而姜黃素對順鉑誘導(dǎo)的HK- 2細胞凋亡是否具有抑制作用的相關(guān)機制不明。基于此課題通過對HK- 2細胞培養(yǎng)并加入順鉑和姜黃素進行實驗，通過檢測細胞中凋亡蛋白的表達探討姜黃素是否對順鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生的腎毒性具有抑制作用，將有助于緩解惡性腫瘤患者腎功能損傷，以提高治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎小管上皮細胞系GF069 HK- 2(上海歌凡生物科技有限公司)；順鉑注射液P4394和姜黃素C7727(Sigma公司)；RPMI 1640(不含雙抗) PYG0050(武漢博士德生物工程有限公司)；RPMI 1640(含雙抗)CM0001(浙江天杭生物科技股份有限公司)；MTT溶液ST316、二甲基亞砜(DMSO)ST038、胰蛋白酶細胞消化液C0201、PBS緩沖液C0221A、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L) A0208、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L) A0216、Bax抗體AB026、Bcl- 2抗體AB112、RIPA裂解液P0013C、BCA蛋白濃度測定試劑盒P0012S和SDS-PAGE凝膠配置試劑盒 P0012A(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組：將HK- 2細胞接種于200 μL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為RPMI 1640(含雙抗)，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，待細胞達70%～80%匯合度時，用胰蛋白酶進行定期消化和傳代。細胞分組為對照組、單純姜黃素組(10 μmol/L姜黃素)、順鉑模型組(順鉑)、低劑量姜黃素保護組(10 μmol/L姜黃素+順鉑)、高劑量姜黃素保護組(20 μmol/L姜黃素+順鉑)，順鉑濃度取IC50值。

1.2.2 MTT實驗檢測細胞增殖：取對照組細胞，用胰蛋白酶消化，調(diào)整制成細胞數(shù)為5×107個/L的細胞懸液，接種于96孔板，每孔加入100 μL。將96孔板置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，棄上清，分別加入不同濃度順鉑的10%胎牛血清培養(yǎng)基100 μL，使其濃度為2、4、8、16、32、64、128、256、512和1 024 μmol/L。每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，將96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24后，每孔分別加入MTT溶液20 μL，避光，培養(yǎng)4 h后,棄上清,加入100 μL DMSO，避光振蕩搖勻培養(yǎng)板10 min，用酶標儀測取吸光度值，波長設(shè)置490 nm處，測量96孔板中各孔吸光度值(A)。重復(fù)實驗，取細胞的清除率為50%時對應(yīng)的順鉑濃度為順鉑IC50。取1.2.1分組細胞接種于96孔板中，檢測細胞增值率。細胞存活率=(實驗組A-空白組A)/(對照組A-空白組A)。

1.2.3 Western blot檢測：取1.2.1分組細胞接種于培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細胞置于冰上，棄除細胞培養(yǎng)基，PBS預(yù)冷后洗滌兩次，加入細胞裂解液，冰上放置30 min，1.5 mL EP管中收集槍頭刮下的細胞， 4 ℃離心25 min，收集上清，蛋白定量后存放于-30 ℃保存。取40～60 μg蛋白進行聚丙酰胺凝膠電泳，300 mA、120 min轉(zhuǎn)膜。一抗為兔抗Bax多克隆抗體、兔抗Bcl- 2多克隆抗體，二抗為羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG。采用電化學(xué)發(fā)光(ECL)液顯影成像。采用GelPr04軟件進行吸光度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MTT實驗結(jié)果

2.1.1 不同濃度順鉑對HK- 2細胞凋亡的影響：起初觀察到順鉑濃度和HK- 2細胞凋亡率為非線性關(guān)系，遂把順鉑濃度C變換為log10C，然后將其與細胞凋亡率做相關(guān)分析，兩者之間呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.991(P<0.05)。log10C為1.31， C為20.41 μmol/L時，細胞凋亡50%，即順鉑IC50為20.41 μmol/L，為方便后續(xù)實驗，取20.00 μmol/L(圖1)。

2.1.2 姜黃素與順鉑單獨及聯(lián)合應(yīng)用對HK- 2細胞增殖的影響：與對照組相比，順鉑組細胞增殖率降低(P<0.05)；與高劑量姜黃素保護組相比，順鉑組細胞增殖率降低(P<0.05)；順鉑組細胞增殖率低于低劑量姜黃素保護組(P<0.05)；高劑量姜黃素保護組細胞增殖率高于低劑量姜黃素保護組(P<0.05)(圖2)。

圖1 順鉑濃度與細胞凋亡的關(guān)系Fig 1 Relationship of “cisplatin-apoptosis”

*P<0.05 compared with control group(0 μmol/L DDP); △P<0.05 compared with DDP(20 μmol/L) ; #P<0.05 compared with DDP(20 μmol/L) and CUR(10 μmol/L)+DDP(20 μmol/L)圖2 不同組別細胞增殖情況Fig 2 Cell survival situation in different groups

2.2 Western blot實驗結(jié)果

與對照組相比，順鉑組Bax蛋白表達上調(diào)(P<0.05)；與順鉑組相比，高劑量姜黃素保護組Bax蛋白表達下調(diào)(P<0.05)；與順鉑組相比，低劑量姜黃素保護組Bax蛋白表達下調(diào)(P<0.05)；與低劑量姜黃素保護組相比，高劑量姜黃素保護組Bax蛋白表達進一步下調(diào)(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control group(0 μmol/L DDP); △P<0.05 compared with DDP(20 μmol/L) ; #P<0.05 compared with DDP(20 μmol/L) and CUR(10 μmol/L)+DDP(20 μmol/L)圖3 不同組別Bax蛋白的表達Fig 3 Bax protein level in different groups

與對照組相比，順鉑組Bcl- 2蛋白表達明顯下調(diào)(P<0.05)；與順鉑組相比，高劑量姜黃素保護組 Bcl- 2蛋白表達上調(diào)(P<0.05)；與順鉑組相比，低劑量姜黃素保護組Bcl- 2蛋白表達上調(diào)(P<0.05)；與低劑量姜黃素保護組相比，高劑量姜黃素保護組Bcl- 2蛋白表達進一步上升(P<0.05)(圖4)。

3 討論

順鉑作為廣譜抗癌藥，臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)順鉑化療腎損害發(fā)生率高達30%，這嚴重影響了患者的治療效果和身體健康。而在藥物性腎損傷中，腎小管外層髓質(zhì)S3段為常見累及部位[8]，S3段細胞上含有機離子轉(zhuǎn)運蛋白2，可進行主動運輸攝入順鉑，順鉑在細胞內(nèi)累積造成順鉑的腎毒性。目前研究證實，姜黃素能夠減輕順鉑誘導(dǎo)的腎毒性,其機制可能與其抗氧化和清除自由基活性有關(guān)，姜黃素通過MAPK信號通路，抑制ERK1/2 的磷酸化，增加抗氧化酶活性，抑制 ROS的產(chǎn)生，減少高糖引起的氧化應(yīng)激損傷[9]。

細胞凋亡受凋亡蛋白的調(diào)控，凋亡蛋白又可分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白， 其中Bax為促凋亡蛋白，Bcl- 2為抗凋亡蛋白。因此Bax與Bcl- 2的表達在細胞凋亡中占有重要作用。在細胞凋亡的內(nèi)源性途徑中，Bax作為線粒體膜上離子通道重要組成部分，可使細胞色素C進入線粒體，與Apaf- 1形成復(fù)合物，從而激活caspase- 9與caspase- 3，促使細胞凋亡的發(fā)生[10]。Bcl- 2可通過阻止細胞凋亡早期環(huán)節(jié)，阻止細胞染色質(zhì)濃縮及DNA裂解，抑制細胞凋亡。本實驗通過Western blot檢測顯示，姜黃素與順鉑聯(lián)合作用時Bax蛋白表達呈下降趨勢，Bcl- 2蛋白表達呈上升趨勢，提示HK- 2細胞凋亡降低。證實了在姜黃素作用下，順鉑作用于HK- 2細胞Bax蛋白表達降低、Bcl- 2蛋白表達增加。

*P<0.05 compared with control group(0 μmol/L DDP); △P<0.05 compared with DDP(20 μmol/L); #P<0.05 compared with DDP(20 μmol/L) and CUR(10 μmol/L)+DDP(20 μmol/L)圖4 不同組別Bcl- 2蛋白的表達Fig 4 Bcl- 2 protein level in different groups

為減輕順鉑的腎損傷，近年來研究者不斷進行探索，除了氨磷汀、維生素C等抗氧化損傷的藥物應(yīng)用于臨床外，主要仍停留在細胞和動物的研究階段，并且這些藥物的效果不確切。姜黃素與順鉑聯(lián)用，從MTT與Western blot實驗的結(jié)果分析可以得知：順鉑對HK- 2細胞具有強烈的增殖抑制作用；當使用姜黃素與順鉑聯(lián)合用藥時，姜黃素可以拮抗順鉑對HK- 2的增殖抑制作用。所以姜黃素作為順鉑的聯(lián)合用藥具有良好的前景，可以減輕惡性腫瘤患者順鉑的腎毒性。

[1] 《中國癌癥防治三年行動計劃(2015-2017年)》制訂[J]. 中國腫瘤臨床與康復(fù)，2016,23:177- 177.

[2] Wang Y,Liu Y,Liu Y,etal.A polymeric prodrug of cisplation based on pullulan for the targeted therapy against hepatocellular carcinoma[J].Int J Pharm,2015,483:89- 100.

[3] 崔亞萌，齊新，魏麗萍，等. 順鉑心臟毒性的研究進展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床，2017,32:351- 355.

[4] 張雪，俸婷婷，喬楊，等. 三種外源物誘導(dǎo)兔原代腎小管上皮細胞構(gòu)建體外腎毒性模型的研究[J]. 中藥藥理與臨床，2016,32:209- 213.

[5] 陳海滔，徐超，姚慶華. 姜黃素通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路抑制結(jié)腸癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[J]. 腫瘤學(xué)雜志，2017,23:35- 39.

[6] Li Z,Pang L,Fang F,etal.Resveratrol attenuates brain damage in a rat model of focal cerebral ischemia via up-regulation of hippocampal Bcl- 2 [J].Brain Res,2012,1045:116- 124.

[7] 黎珊珊，徐兆發(fā). 姜黃素激活Nrf2-ARE通路抑制鎘腎毒性的研究進展[J]. 環(huán)境與健康雜志，2014,31:90- 93.

[8] Vickers AE, Rose K, Fisher R,etal.Kidney slices of human and rat characterize cisplatin-induced injury on cellular pathways and morphology[J].Toxicol Pathol,2004,32:577- 590.

[9] 李軍，熊琨，龔元，等. 基于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的姜黃素抗氧化機制研究進展[J]. 中草藥，2016,47:2373- 2380.

[10] 程新燕，符翠莉.芹菜素對大鼠骨肉瘤細胞凋亡及相關(guān)蛋白Bax,Bcl- 2,caspase- 3,caspase- 9,細胞色素C的影響[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2016,22:139- 142.