黃芪多糖減輕慢性鎘暴露誘導(dǎo)的大鼠肝臟損傷

安方玉，顏春魯,2*，劉永琦，伍志偉，蘇 韞，牛彥強(qiáng)，柳鵬瑤

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 1.教學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)中心；2.甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4.臨床醫(yī)學(xué)院；5.中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅 蘭州730000)

鎘(cadmium，Cd)是一種毒性大、蓄積性強(qiáng)的重金屬毒物[1]。當(dāng)攝入量逐漸增加時，可引起機(jī)體多臟器產(chǎn)生不同程度的損害作用[2]。長期低劑量的鎘攝暴露可造成肝臟不同程度的氧化應(yīng)激損傷，會引起肝發(fā)生炎性反應(yīng)、水腫和出血等病理改變[3]。黃芪具有保肝、利尿、抗衰老和抗應(yīng)激等藥理作用[4]。但對其慢性鎘中毒大鼠肝臟損傷的保護(hù)作用尚不明確。本研究以大鼠慢性鎘中毒模型為對象，觀察黃芪多糖對氯化鎘所致大鼠肝臟損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：SPF級Wistar大鼠36只，體質(zhì)量(180±20)g，雌雄各半[甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證編號：SCXK(甘)2011- 0001- 0001344]。

1.1.2 試劑：氯化鎘(天津市巴斯夫化工有限公司)；羧甲基纖維素鈉 (天津市大茂化學(xué)試劑廠)；考馬斯亮蘭試劑盒和AST、ALT及LDH檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Rat IL- 2 precocated ELISA kit 和Rat TGF-β precocated ELISA kit檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司)；Bax和Bcl- 2抗體(ImmunoWay Biotechnology公司)；藥材選用甘肅地道藥材黃芪，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心藥物制劑實(shí)驗(yàn)室提取、分離、鑒定(純度達(dá)到50%以上)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理：將大鼠隨機(jī)分為3組：對照組、模型組(腹腔注射0.1%氯化鎘，1.5 mg/kg相當(dāng)于1.5 mL/kg，5次/周，共5周)、黃芪多糖干預(yù)組(給予黃芪多糖20 mg/kg灌胃治療，1次/d，連續(xù)5周)，每組12只。末次給藥后，取肝臟備用。

1.2.2 大鼠肝指數(shù)測定的結(jié)果：末次給藥24 h后，稱量大鼠體質(zhì)量，股動脈采血處死大鼠。摘取大鼠的肝臟稱重并計(jì)算肝指數(shù)。肝指數(shù)=肝臟質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.2.3 大鼠肝組織細(xì)胞因子測定結(jié)果：按照ELISA試劑盒說明書測定大鼠肝組織白細(xì)胞介素- 2(IL- 2)及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的含量。肝勻漿液的制備采用1:10比例。

1.2.4 大鼠肝組織酶活性和Cd含量測定結(jié)果：均嚴(yán)格按照試劑盒說明測定肝組織谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)活性、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)活性和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性，鎘(Cd)含量。肝勻漿液制備同1.2.3。

1.2.5 大鼠肝組織Bcl- 2和Bax蛋白表達(dá)的測定：采用SP法，加入Bax和Bcl- 2抗體(1∶300，1∶400)，4 ℃孵育過夜。次日，加入相應(yīng)生物素標(biāo)記的二抗(1∶100)孵育，最后經(jīng)DAB 顯色、質(zhì)染。以染色呈棕黃色或棕褐色顆粒表達(dá)為陽性結(jié)果。400倍鏡下每張切片隨機(jī)選取5個視野，每視野選5個陽性區(qū)域進(jìn)行平均吸光度值測量，表達(dá)強(qiáng)弱與吸光度值呈反比。

1.2.6 大鼠血清酶活性測定結(jié)果：按照試劑盒說明書測定血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性和乳酸脫氫酶(LDH)活性。 血清的制備采用股動脈采血和靜置，離心的方法獲得。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝指數(shù)的測定結(jié)果

與對照組比較，模型組大鼠肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖干預(yù)組大鼠肝臟指數(shù)明顯回降(P<0.05)(表1)。

表1 各組動物肝臟指數(shù)結(jié)果比較

#P<0.05 compared with control；*P<0.05 compared with model.

2.2 大鼠肝組織細(xì)胞因子含量測定結(jié)果

與對照組比較，模型組大鼠肝組織IL- 2含量顯著降低，TGF-β1含量顯著升高(P<0.01)；與模型比較，黃芪多糖干預(yù)組大鼠肝組織IL- 2含量回升，TGF-β1含量顯著回降(P<0.01)(表2)。

表2 各組動物肝組織IL- 2和TGF-β1含量比較

#P<0.01 compared with control；*P<0.01 compared with model.

2.3 大鼠肝組織酶活性和Cd含量測定結(jié)果

與對照組比較，模型組大鼠肝組織AST、ALT與LDH活性和Cd含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，黃芪多糖干預(yù)組大鼠肝組織AST、ALT與LDH活性和Cd含量均顯著回降(P<0.01)(表3)。

表3 各組動物肝組織AST、ALT及LDH的活性和Cd含量比較

#P<0.01 compared with control；*P<0.01 compared with model.

2.4 大鼠肝組織Bcl- 2活性和Bax蛋白表達(dá)結(jié)果

Bcl- 2和Bax在正常機(jī)體的表達(dá)主要在肝細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)。與對照組比較，鎘染毒模型組大鼠肝組織中Bcl- 2表達(dá)下降，Bax表達(dá)升高(P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖干預(yù)組大鼠肝組織Bcl- 2表達(dá)回升，Bax表達(dá)回落(P<0.05)(表4,圖1)。

表4 各組動物肝組織Bcl- 2和Bax蛋白表達(dá)吸光度值比較

*P<0.05，**P<0.01 compared with model；#P<0.01 compared with control.

2.5 大鼠血清酶活性測定結(jié)果

與對照組比較，模型組大鼠血清AST、ALT、LDH活性均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，黃芪多糖干預(yù)組大鼠血清AST、ALT、LDH活性均顯著回降(P<0.05)(表5)。

A.control; B.model; C.astragalus polysaccharides intervention圖1 各組大鼠肝組織Bcl- 2和Bax蛋白表達(dá)Fig 1 Protein expressin of Bcl- 2 and Bax in liver tissue of each group rats(IHC-P，×400)

groupASTALTLDHcontrol120±1832.71±5.43930±79model162±20#75.33±7.28#1537±84#Astragaluspolysaccharidesintervention131±16** 44.02±6.81** 1281±114*

*P<0.05，**P<0.01 compared with model；#P<0.01 compared with control.

3 討論

鎘攝入過量可在機(jī)體包括肝等多種組織器官中沉積。其毒性作用可能是蓄積在肝中的鎘一方面使肝細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量自由基，進(jìn)一步加重膜結(jié)構(gòu)的破壞，從而加重鎘對肝組織的損害[5]；另一方面鎘會使肝細(xì)胞通透性發(fā)生改變，肝組織AST和ALT可隨染鎘劑量的增加和時間的延長急劇升高，因此，肝臟AST和ALT活性增強(qiáng)是反映肝損傷最敏感的指標(biāo)[6]；最后，大量鎘攝入機(jī)體會導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生代謝紊亂，導(dǎo)致某些酶活性發(fā)生改變。此外，細(xì)胞因子在鎘毒中主要參與免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)。其中，IL- 2通過和IL- 2R作用，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的細(xì)胞免疫、體液免疫和NK細(xì)胞的殺傷活性[7]。TGF-β1 主要參與調(diào)節(jié)免疫、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促進(jìn)ECM形成等多種生理功能[8]。

近年來，Bcl- 2家族在鎘毒中的作用也逐漸被關(guān)注，Bcl- 2和Bax是一對調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵基因[9]。Bcl- 2為抑制細(xì)胞凋亡的基因，而Bax是一個能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因[10]。因此，Bcl- 2的表達(dá)升高和Bax的表達(dá)降低，有利于細(xì)胞的存活。有研究發(fā)現(xiàn)，急慢性鎘暴露可影響細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11- 12]。本實(shí)驗(yàn)表明，大鼠腹腔注射氯化鎘后，其肝及血清中ALT、AST及LDH活性均增強(qiáng)，并且肝組織Cd含量、TGF-β1含量和Bax的蛋白表達(dá)均升高，而肝組織IL- 2含量和Bcl- 2的蛋白表達(dá)均降低，說明鎘可以引發(fā)大鼠肝的氧化應(yīng)激損傷、免疫功能受損或可能發(fā)生纖維化；而黃芪多糖干預(yù)組可明顯降低肝及血清中上述酶的活性、可明顯升高肝組織IL- 2含量和Bcl- 2的蛋白表達(dá)，降低肝組織TGF-β1含量和Bax的蛋白表達(dá)，提示其對肝臟的保護(hù)作用是通過調(diào)節(jié)酶活性、免疫功能和Bcl- 2/Bax的蛋白表達(dá)來完成的。

總之，黃芪對鎘染毒大鼠肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)Bcl- 2/Bax的蛋白表達(dá)，間接實(shí)現(xiàn)對肝組織細(xì)胞因子及酶活性的調(diào)控作用，從而減緩鎘在肝組織的沉積，進(jìn)而促進(jìn)鎘在機(jī)體的重新分布，但黃芪對鎘中毒的干預(yù)機(jī)制尚需進(jìn)一步深入探究。

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