CD11c+DCs促K14-VEGF轉基因小鼠銀屑病樣發病

張 怡，周 彪，郭政宏，龍 虎，嚴亨秀

(西南民族大學， 四川 成都 610041)

FLT3配體(ligand of FMS-like tyrosine kinase 3，FL)是刺激樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)成熟的主要的幾種生長因子之一[1],FL/FLT3信號使DCs維持特定的功能。因此，FLT3可以作為靶分子，通過影響DCs調節，進而調節免疫應答。有研究使用FLT3抑制劑治療急性髓性白血病[2]；還有使用FLT3抑制劑CEP- 701抑制DCs治療C57小鼠的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)[3]，有效改善了發病小鼠的癥狀，但其作用機制仍不清楚。

DCs是機體內最強的專職抗原遞呈細胞，可以有效刺激初始性T細胞活化，是機體免疫反應的主要啟動者。DCs作為T細胞的上游，特定的DCs亞型刺激T細胞分化為特定亞型。比如，DCs可以分泌IL- 23、TGF-β和IL- 6等細胞因子，刺激T細胞分化為Th17細胞，Th17細胞在特定的免疫機制中發揮重要的作用[4]。因此，以DCs為靶細胞改善機體的免疫力將是一種比以T細胞為靶細胞更為精確和有效的治療免疫性疾病的方法。

本研究通過向K14-VEGF轉基因小鼠皮下注射FMS樣酪氨酸激酶3陽性樹突狀細胞(CD11c+DCs)，觀察并分析CD11c+DCs在銀屑病模型鼠中的作用及其免疫機制。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級K14-VEGF轉基因小鼠，6周齡雄性，體質量約為25 g(四川大學生物治療國家重點實驗室饋贈)是自身性免疫性疾病銀屑病的轉基因鼠模型[5]。K14-VEGF轉基因小鼠具有穩定的銀屑病臨床表現，幼鼠在最初不會表現銀屑病的臨床癥狀，3月齡小鼠的耳朵和頸部小部分皮膚開始出現銀屑病樣改變，包括表皮增生，表皮分化能力改變，血管黏附分子上調等特征。5月齡以上小鼠銀屑病樣癥狀加重，背部發病，病理區逐漸擴大，直至最后紅斑結痂滲出液覆蓋耳朵和背部大面積皮膚。

飼養小鼠的動物房溫度為(25±1)℃，相對濕度為60%±10%，自由攝食與飲水。

小鼠白細胞介素4(IL- 4)，小鼠粒細胞巨噬細胞集落因子(GM-CSF)和小鼠FLT3配體(FL)(PeproTech公司)；亞美尼亞倉鼠抗小鼠CD11c抗體(Abcom公司)；兔抗小鼠FLT3抗體(Santa Cruz公司)；羊抗兔-FITC熒光標記二抗和蛋白A熒光-TRITC熒光標記二抗(武漢博士德生物工程有限公司).

1.2 方法

1.2.2 體外CD11c+DCs的誘導培養：為了獲得純度較高的CD11c+DCs，用IL- 4、GM-CSF和FL等細胞因子誘導DCs定向分化及成熟，采用半量換液法去除漂浮的非樹突狀細胞，棄去的懸浮細胞中主要包括T細胞、B細胞、粒細胞、死細胞、細胞碎片及少量單核細胞和樹突狀細胞。具體方法是取BABL/c小鼠雙側股骨和脛骨內骨髓細胞。細胞計數，調整細胞為(1～2)×10-6/mL，使用含有IL- 4(20 ng/mL)、GM-CSF(20 ng/mL)和FL(FLT3配體)(10 ng/mL)的RPMI 1640(含血清&抗生素)培養基培養細胞，2、4、6和8 d吸取最上層培養基半量換液，第9天收細胞，流式抗體CD11c-PerCP和FLT3-PE染色，使用流式細胞計量術分析。

1.2.3 K14-VEGF小鼠皮下注射CD11c+DCs：選取12只6周齡未發病K14-VEGF轉基因小鼠，隨機分為對照組(n=6)和實驗組(n=6)。重復1.2.2中的方法培養CD11c+DCs細胞，分別于第1天和第8天注射入實驗組小鼠頸部皮下[6]，對照組小鼠皮下注射培養基作為對照。

1.2.4 對實驗小鼠進行分析：觀察小鼠臨床表現以及病理區變化情況，依據小鼠銀屑病樣皮損面積和疾病嚴重程度(psoriasis area and severity index，PASI)評分標準給予小鼠皮損處紅斑(erythema)、鱗屑(scales)和浸潤增厚程度(thickness)0～4的積分: 0，無；1，輕度；2，中度; 3，重度; 4，極重度。將3者積分相加得到總積分(0～12)，紅斑根據顏色深淺，鱗屑根據覆蓋面積占發病皮膚總面積的比例計算，對各組小鼠皮損總積分取平均值后繪制趨勢線。

注射后第21天取小鼠耳部、頸部以及頸部至背部約1.5 cm的皮膚做石蠟切片，進行HE染色，檢測組織學變化；流式細胞術分析實驗組和對照組小鼠骨髓、血液、脾臟和頜下淋巴結中的T淋巴細胞和DCs的變化；免疫熒光法分析小鼠皮損中CD4、CD8、IL- 17a、IFN-γ和CD31的變化；HE染色方法觀察小鼠心、肝、脾、肺和腎的變化。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 CD11c+DCs表型鑒定

成熟DCs形狀似星形、多邊形或梭形， FLT3分子和CD11c分子分布于成熟CD11c+DCs表面。圖1C為熒光雙染圖片，綠色熒光(圖1A)標記的FLT3分子和紅色熒光(圖1B)標記的CD11c分子同時在CD11c+DCs細胞膜顯色，反映FLT3分子和CD11c分子在DCs膜上表達陽性。K14-VEGF小鼠皮損中90% FLT3陽性細胞表達CD11c。

A. FLT3-FITC; B. CD11c-PE; C. merge image of double immunofluorescence圖1 免疫熒光雙染法對CD11c+DCs進行表型鑒定Fig 1 Phenotype identification of CD11c+DCs by immunofluorescence

2.2 CD11c+DCs對K14-VEGF轉基因小鼠的影響

2.2.1 CD11c+DCs流式細胞術檢測：圖2A為培養中的DCs，可見明顯的樹突狀分支和模糊的細胞核。

誘導培養至第9天，CD11c+DCs細胞比率為80.23%±3.10%(n=6)(圖2B)。

選取適合的截止高度角，保障算法的可用性，設置好檢測門限閾值，可以有效地進行周跳的探測。成功探測到周跳后，利用Chebyshev多項式擬合進行計算修復。值得注意的是，本文的方案可以有效地對獨立的單頻接收機發生的周跳進行探測和修復，減小了對接收機性能的要求，增強系統的可靠性。

A.form of DCs; B.purity detection of bone marrow cells by flow cytometry圖2 IL- 4、GM-CSF和FL誘導分化后的CD11c+DCsFig 2 CD11c+DCs induced by IL- 4, GM-CSF and FL

2.2.2 K14-VEGF轉基因小鼠注射CD11c+DCs后的臨床表現：實驗組小鼠在第3天耳朵面部出現少量紅斑，對照組小鼠無變化。隨著時間延長，實驗組小鼠銀屑病樣皮損逐漸加重，在第7天已有小鼠兩耳間出現明顯紅斑，少量的結痂，皮膚的增厚。對照組小鼠仍無任何銀屑病樣臨床癥狀。第8天進行第2次細胞注射，注射部位與第1次相同，繼續觀察小鼠。在第21天時實驗組小鼠耳朵背部皮膚出現紅斑，結痂較多，皮膚有滲出液且較厚，嚴重的有血點出現，而對照組只有部分小鼠耳朵面部剛剛出現紅斑(圖3)。

實驗組小鼠比對照組小鼠發病快，且發病程度十分嚴重。第21天時，實驗組小鼠紅斑平均積分、鱗屑的平均積分和浸潤增厚程度的平均積分均顯著高于對照組。實驗組小鼠PASI的平均總積分顯著低于對照組(P<0.01)(表1)。

2.2.3 小鼠皮損處組織學變化:第21天所有實驗小鼠的耳朵和背部皮膚切片組織學觀察并統計結果如下。

2.2.3.1 實驗組小鼠耳部和背部表皮層厚度增加。第21天實驗組小鼠耳朵皮膚表皮厚度為(29±4)μm，顯著高于對照組的(11±2)μm(P<0.01)(圖4A)。

實驗組小鼠背部皮膚表皮厚度為(25±3)μm，顯著高于對照組(9±1)μm(P<0.01)(圖4B)。

2.2.3.2 實驗小鼠耳朵棘突明顯增加。皮膚中發現棘突結構是人類銀屑病患者最典型且最容易識別的組織學表現，只在K14-VEGF轉基因模型鼠中才有棘突結構的出現。

棘突結構表現在K14-VEGF發病小鼠耳朵腹側面皮膚表皮層。伴隨棘突結構的出現，銀屑病癥狀會加重，如炎性細胞浸潤增加，角化過度和局灶性角化不全增強。實驗組小鼠單位長度棘突數量為11.9±4.1，顯著高于對照組的2.0±1.3(P<0.01，n=6)，表明實驗組小鼠已具有一種典型銀屑病樣變化(圖4C)。

2.2.4 多個免疫器官中CD11c+DCs和T淋巴細胞減少:1)與對照組相比，實驗組小鼠骨髓和淋巴結中CD11c+CD11c+DCs顯著降低 (圖5，表2)。2) 實驗小鼠T淋巴細胞明顯降低，其中Th17和Th1均下降。

實驗組小鼠血液中CD3+CD4+T淋巴細胞數為(17.87±0.23)個，明顯低于對照組(31.77±0.54)(P<0.01，n=6)(圖6A)。

與對照組相比，實驗組小鼠骨髓、血液、脾臟及頜下淋巴結中的CD3+CD4+IL- 17a+Th17細胞及CD3+CD4+IFN-γ+Th1細胞數量均顯著降低(P<0.01)(圖6B，表3)。

2.2.5 皮損處CD4+、CD8+、IL- 17a+和IFN-γ+淋巴細胞和血管改變：實驗組小鼠CD4+、CD8+、IL- 17a+或IFN-γ+細胞數顯著高于對照組(P<0.01，n=6)；實驗組小鼠血管數也較對照組明顯增加(P<0.01，n=6)(圖7，表4)。

圖3 實驗小鼠臨床表現和PASI積分Fig 3 Clinical manifestation and PASI scores of mice skin lesions

grouperythemascalesthicknessPASIcontrol 0.83±0.41 0.50±0.55 0.17±0.41 1.50±1.05experiment 2.67±0.52* 2.33±0.52* 2.00±0.63* 7.00±0.89*

*P<0.01 compared with control.

A.ear skin; B.back skin; C.epidermal rete ridge structures from ear skin圖4 細胞注射后21 d時小鼠耳部和背部受損皮膚Fig 4 Mice ear and back skin lesions on day 21 after injecting DCs

圖5 小鼠骨髓和頜下淋巴結內的CD11c+DCs數量顯著變化Fig 5 Significient change of the number of CD11c+DCs from bone marrow and submaxillary lymph nodes in mice

groupbonemarrowsubmaxillarylymphnodescontrol1.76±0.302.29±0.36experiment0.14±0.03*0.47±0.05*

*P<0.01 compared with control.

2.2.6 實驗組小鼠心、肝、脾、肺和腎的組織學特征無明顯改變:實驗組小鼠與對照組小鼠比較，各臟器組織形態無明顯變化，表明CD11c+DCs注射對內臟無明顯不良反應。

3 討論

在銀屑病中，pDCs和mDCs分泌IFN-α、IL- 12和IL- 23，進而刺激初始T細胞分化為Th1和Th17細胞[7]。在注射CD11c+DCs后，皮損處的CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、IL- 17a+細胞、IFN-γ+細胞和CD31分子均顯著增多。CD8+T淋巴細胞增多提示，CD8+炎性淋巴細胞滲出增多；CD31分子染色顯示，血管數量增多：提示皮損區血管擴張和數量增加。銀屑病皮損中CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞產生IL- 17[8]。銀屑病是由Th17/Th1混合介導的自身免疫性疾病[6,9]。Th1和Th17細胞為CD4+T細胞分化而來，INF-γ由Th1產生，且是Th1的標志性細胞因子；IL- 17由Th17產生，且是Th17的標志性細胞因子。IL- 17具有致炎性[10]，可以誘導促炎細胞因子、趨化因子和基質金屬蛋白酶的表達，引起組織細胞浸潤和組織破壞。IL- 17協同IFN-γ通過人類角質形成細胞增加前炎性細胞因子的產生，也許會參與中性粒細胞在銀屑病皮損中的浸潤(血管周圍中性粒細胞的浸潤和表皮中性粒細胞微膿瘍的形成)。

A.number of CD3+CD4+T lymphocytes cells; B.number of Th1, Th17 cells from bone marrow, spleen, submaxillary lymph nodes and blood in mice

圖6 K14- VEGF轉基因小鼠骨髓、脾臟、頜下淋巴結和血液中的T淋巴細胞數

*P<0.05，**P<0.01 compared with control.

All the data between the experimental group and the control group is significantly圖7 小鼠皮損處CD4+, CD8+, IL- 17a+, IFN-γ+和CD31+細胞的免疫熒光Fig 7 CD4+, CD8+, IL- 17a+, IFN-γ+ and CD31+ immunofluorescence in the lesion skins of K14-VEGF mice

groupCD4+CD8+IL-17a+IFN-γ+CD31+control7.12±1.455.64±1.226.43±1.219.76±2.4424.50±4.53experiment21.32±2.31*13.43±2.12*19.86±2.87*25.54±11.68*53.30±9.86*

*P<0.01 compared with control.

在骨髓的流式細胞術分析中，實驗組CD11c+FLT3+DCs少于對照組。頜下淋巴結在小鼠的頸部，距K14-VEGF小鼠發病皮膚較近。實驗組CD11c+FLT3+DCs細胞數少于對照組。實驗組中的脾臟和血液中的CD11c+FLT3+DCs細胞數量與對照組相比未見差異。

對骨髓、脾臟、頜下淋巴結和血液的流式細胞術分析表明，血液中的CD3+CD4+雙陽性細胞數量減少，其他組的CD3+CD4+雙陽性細胞數量無顯著性差異。在CD3+CD4+IL- 17a+和CD3+CD4+IFN-γ+的流式細胞術分析中，實驗組細胞數量均減少，且具有極顯著差異。

皮損處CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、IL- 17a+細胞、IFN-γ+細胞和血管數均增多，致使小鼠皮膚表皮層和顆粒層增厚，出現棘突，皮膚出現鱗屑、紅斑和結痂等臨床特征。證明CD11c+DCs通過直接或間接對CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、IL- 17a+細胞、IFN-γ+細胞和CD31分子等產生作用促進K14-VEGF小鼠發病。

背部注射CD11c+DCs后，小鼠體內DCs和T細胞數量減少。被激活的DCs可以通過分泌IL- 6，增強效應T細胞的功能，限制調節性T細胞的數量[11]。調節性T細胞抑制效應T細胞用來維持免疫平衡狀態。反過來，不受限制的效應T細胞會減少調節性T細胞的數量或降低功能，引起自身免疫性疾病[12]。有報道，銀屑病中的調節性T細胞機能下降，抑制能力減弱[13]。或許CD11c+DCs與體內DCs和T細胞之間有一種抑制機制，但是作用通路尚不可知，還有待進一步研究。

[1] O’Keeffe M, Hochrein H, Vremec D,etal. Effects of administration of progenipoietin 1, Flt- 3 ligand, granulocyte colony-stimulating factor, and pegylated granulocyte-macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell subsets in mice[J]. Blood, 2002, 99:2122- 2130.

[2] Mark L, Donald S. Novel FLT3 tyrosine kinase inhibitors[J]. Int J Hematol, 2005, 82:100- 107.

[3] Whartenby KA, Calabresi PA, Erin MC,etal. Inhibition of FLT3 signaling targets DCs to ameliorate autoimmune disease[J]. Proc Natl Acad Sci, 2005, 102: 16741- 16746.

[4] Huh JR, Leung MW, Huang P,etal. Digoxin and its derivatives suppress TH17 cell differentiation by antagoniz-ing RORγt activity[J]. Nature, 2011, 472:486- 490.

[5] Xia YP, Li B, Hylton D,etal. Transgenic delivery of VEGF to mouse skin leads to an inflammatory condition resembling human psoriasis[J]. Blood, 2003, 102:161- 168.

[6] Singh TP, Schon MP, Wallbrecht K,etal. 8-methoxypsoralen plus ultraviolet A therapy acts via inhibition of the IL- 23/Th17 axis and induction of Foxp3+ regulatory T cells involving CTLA4 signaling in a psoriasis-like skin disorder[J]. J Immunol, 2010, 184:7257- 7267.

[7] Lee MR, Cooper AJ. Immunopathogenesis of psoriasis[J]. Exp Dermatol, 2007, 16:779- 798.

[8] Consuelo O, Silvia FA, Carrillo JM,etal. IL- 17-producing CD8+T lymphocytes from psoriasis skin plaques are cytotoxic effector cells that secrete Th17-related cytokines[J]. J Leukocyte Biol, 2009, 86:435- 443.

[9] Fitch EL, Rizzo HL, Kurtz SE,etal. Inflammatory skin disease in K5.hTGF-beta1 transgenic mice is not depend-ent on the IL- 23/Th17 inflammatory pathway[J]. J Invest Dermatol, 2009, 129: 2443- 2450.

[10] Park H, Li Z, Yang XO,etal. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17[J]. Nat Immunol, 2005, 6:1133- 1141.

[11] Goodman WA, Levine AD, Massari JV. IL- 6 signaling in psoriasis prevents immune suppression by regulatory T cells[J]. J Immunol, 2009, 183:3170- 3176.

[12] Buckner JH. Mechanisms of impaired regulation by CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells in human autoimmune diseases[J]. Nat Rev Immunol. 2010,10: 849- 859.

[13] Hideaki S, Rolland G, Eiko T,etal. Dysfunctional blood and target tissue CD4+CD25 high regulatory T cells in psoriasis: mechanism underlying unrestrained pathogenic effector T cell proliferation[J]. J Immunol, 2005, 174:164- 173.