高脂飲食誘導小鼠血糖增高損傷睪丸微血管功能

張曉艷，李炳蔚，劉明明，尚 飛，劉淑英，盛有明，李宏偉，修瑞娟

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 微循環研究所 衛生部微循環重點實驗室，北京 100005)

近年來，高脂飲食對雄性生殖功能損害不斷受到關注[1- 3]。高脂飲食可誘導大鼠發生早期糖尿病癥狀，表現為空腹血糖水平增高、伴或不伴有糖耐量異常[4- 6]，而高血糖能損傷小鼠睪丸微血管內皮細胞，間接誘導睪丸生精功能障礙[7]。目前針對高脂飲食誘導的小鼠睪丸微循環障礙、微血管損傷對生精細胞的影響報道較少。因此，本研究利用高脂飲食飼養C57BL/6雄性小鼠20周，觀察小鼠睪丸微循環和微血管形態、功能改變及生精細胞的病理組織學變化，探索高脂飲食誘導雄性生殖功能損害機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：羊抗兔血小板內皮細胞黏附分子- 1抗體(CD31)及增殖細胞核抗原(PCNA)(Abcam公司)；TUNEL檢測試劑盒(Roche公司)；伊文思藍染色劑(Evans Blue)(Sigma公司)；免疫組化抗原修復液(北京康為世紀公司)；高脂飼料(D12492)及普通維持飼料(中國醫學科學院動物研究所)。

1.1.2 實驗動物：40只SPF級7 ～ 8周雄性C57BL/6小鼠，體質量(23±2)g(中國醫學科學院動物研究所[SCXK(京)2009- 0007])。飼養在室溫21 ℃～23 ℃、濕度45%～55%、12 h明暗交替，自由進食水。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組及處理：將小鼠分為對照(control)和高脂飼料喂養20周的高脂組(high fat diet, HFD)，每周測體質量及空腹血糖。

本研究方案經中國醫學科學院微循環研究所倫理委員會審核批準。

1.2.2 睪丸通透性的檢測：禁食水4 h，腹腔注射2%伊文思藍。3 h后1.5%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，灌流心臟，取睪丸固定包埋，液氮速凍，-80 ℃保存。20 μm冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察生精小管內伊文思藍染色。

1.2.3 睪丸微循環血流灌注水平和自律運動的檢測：Moor VMS-LDF激光多普勒血流灌注監測系統檢測小鼠睪丸微循環血流量及睪丸微血管自律運動。Moor VMS PC2.1軟件提取各時相睪丸血流灌注水平(perfusion unit，PU)，計算平均灌注量(PU/min)。以單位時間內多普勒血流圖波峰及波谷頻數計算睪丸微血管自律運動頻率(cycle per minute, CPM, 周期/分鐘)，以單位時間內多普勒血流圖波峰與波谷血流灌注單位差值計算睪丸微血管自律運動振幅(△PU)。

1.2.4 HE染色觀察睪丸病理組織學變化：常規制片觀察睪丸組織。

1.2.5 免疫組織化學染色檢測CD31及PCNA表達：切片脫蠟水化，按免疫組化常規處理切片，1∶50加入CD31，1∶4 000加入PCNA抗體，4 ℃過夜；常規二抗室溫下孵育20 min，DAB染色，蘇木精復染，脫水透明，中性樹膠封片。睪丸微血管內皮細胞、生精細胞棕黃色染色為CD31、PCNA表達陽性，應用Image-Pro Plus 6.0軟件對陽性表達區域進行積分吸光度值(integrated absorbance,IA)定量分析。

1.2.6 TUNEL染色法檢測：切片脫蠟至水，按TUNEL染色試劑盒說明書操作，凋亡生精細胞為深棕色染色。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 空腹血糖及體質量結果比較

HFD組小鼠高脂飲食20周后，體質量為(45±3)g，顯著高于對照組的(32±4)g (P<0.01)；空腹血糖為(9.96±1.57)mmol/L，顯著高于對照組的(5.32±1.16) mmol/L (P<0.01)。

2.2 睪丸通透性實驗結果

對照組僅在睪丸間質和生精小管基底膜處有紅色熒光標記，生精小管內無可見熒光染色；而HFD組生精小管內有熒光物質表達(圖1)。

EB.evans blue圖1 兩組小鼠睪丸Evanse blue染色結果Fig 1 Evans blue staining of the mice testis in two groups(×400)

2.3 睪丸微血管血流灌注水平及睪丸微血管自律運動

對照組小鼠睪丸表面微血管血流灌注持續穩定，HFD組睪丸血流灌注量降低(P<0.01)，睪丸微血管自律運動頻率(P<0.05)及振幅(P<0.01)均降低(圖2)。

A.testicular blood perfusion in two groups；B.frequency of vasomotion；C.amplification of vasomotion; *P<0.05, **P<0.01 compared with control圖2 兩組小鼠睪丸微血管血流灌注水平、自律運動頻率及振幅的變化Fig 2 Comparison of testicular blood perfusion, frequency and amplification of vasomotion

2.4 睪丸組織形態學觀察

HFD組小鼠睪丸生精上皮破壞嚴重，生精小管萎縮，Sertoli細胞和各級生精細胞之間的黏附松散，生精上皮有空泡樣改變(圖3)。

圖3 兩組小鼠睪丸組織形態學觀察(HE)Fig 3 Histomorphology in testis between two groups

2.5 睪丸組織CD31及PCNA免疫組化表達量

HFD組小鼠睪丸微血管內皮細胞CD31表達斷續或無表達，IA值為(1.22±0.10)×107，表達量顯著低于對照組的(3.23±0.13)×107(P<0.01)；HFD組生精細胞PCNA表達減少，IA值為(0.74±0.04)×108，顯著低于對照組的(2.18±0.17)×108(P<0.01)(圖4)。

2.6 睪丸組織生精細胞TUNEL表達水平

HFD組可見各級生精細胞凋亡，IA值為(1.77±0.15)×107，顯著高于對照組的(0.87±0.04)×107(P<0.01)(圖5)。

圖5 兩組小鼠睪丸生精細胞TUNEL表達水平Fig 5 TUNEL expression level of germ cells in testis between two groups(×400, ±s, n=5)

3 討論

睪丸微循環承擔著睪丸內雄激素、氧和營養物質等的運輸及代謝產物的交換釋放[8]，微血管內皮細胞是睪丸微循環的結構基礎，完整的微血管內皮細胞對維持睪丸微循環的功能至關重要。睪丸內血流的變化與精子發生緊密相關[9]， 睪丸微循環障礙可降低睪丸微血管灌注水平，致睪丸組織缺氧，嚴重者可使睪丸局部組織梗死并最終造成雄性不育[10]。本研究發現，HFD組小鼠睪丸微血管內皮細胞CD31表達缺失，睪丸微血管血流灌注量以及微血管自律運動頻率、振幅均降低，提示HFD組小鼠睪丸微血管受損。

血睪屏障是睪丸毛細血管和生精小管之間的一種功能性結構，睪丸微血管是血睪屏障的重要組成部分。血睪屏障可保護生精細胞免受血源性毒素以及生精上皮自體免疫反應的侵害，使正常精子發生過程得以順利進行[11- 13]。有研究報道，高脂飲食能破壞家兔血睪屏障并使家兔不育[14]；本研究HFD組小鼠空腹血糖水平顯著增高，提示長期高脂飲食可致C57BL/6雄性小鼠發生糖尿病前驅癥狀。由于糖毒性可致睪丸微血管內皮細胞受損，推測高脂飲食誘導小鼠血糖增高導致睪丸微血管內皮細胞損傷使睪丸微血管通透性增加，破壞血睪屏障完整性。伊文思藍染色結果顯示，HFD組小鼠睪丸生精小管內出現熒光染料，表明血睪屏障完整性受損。同時，組織學實驗結果顯示，HFD組小鼠睪丸生精上皮出現空泡樣損傷，各級生精細胞均見凋亡，且生精細胞增殖不良。提示高脂飲食誘導小鼠血糖增高使睪丸微血管內皮細胞受損、破壞血睪屏障完整性，導致生精細胞凋亡及增殖水平異常，使生精上皮受損，并影響精子發生。

綜上所述，高脂飲食誘導C57BL/6小鼠血糖增高，糖毒性繼發損傷睪丸微血管內皮細胞，使微血管灌注功能障礙[15]；受損的睪丸微血管通透性增加，破壞血睪屏障完整性，使小鼠精子發生的內環境紊亂，生精上皮受損且生精細胞增殖凋亡異常，最終可致雄性不育。通過糾正由高脂飲食誘導的高血糖,改善睪丸微血管損傷程度，可能成為臨床針對高脂飲食誘導男性不育癥的治療靶點之一。

[1] Erdemir F, Atilgan D, Markoc F,etal. The effect of diet induced obesity on testicular tissue and serum oxidative stress parameters [J]. Actas Urol Esp, 2012, 36: 153- 159.

[2] Jensen TK, Heitmann BL, Blomberg JM,etal. High dietary intake of saturated fat is associated with reduced semen quality among 701 young Danish men from the general population [J]. Am J Clin Nutr, 2013, 97: 411- 418.

[3] Dupont C, Faure C, Sermondade N,etal. Obesity leads to higher risk of sperm DNA damage in infertile patients [J]. Asian J Androl, 2013, 15: 622- 625.

[4] Rato L, Alves MG, Dias TR,etal. High-energy diets may induce a pre-diabetic state altering testicular glycolytic metabolic profile and male reproductive parameters [J]. Andrology, 2013, 1: 495- 504.

[5] Utzschneider KM, Prigeon RL, Faulenbach MV,etal. Oral disposition index predicts the development of future diabetes above and beyond fasting and 2- h glucose levels [J]. Diabetes Care, 2009, 32: 335- 341.

[6] American Diabetes Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus [J]. Diabetes Care, 2012, 35(Suppl 1): S64- 71.

[7] 張曉艷, 劉明明, 李炳蔚, 等. 觀察鏈脲佐菌素誘導的balb/c糖尿病小鼠睪丸微循環損害 [J]. 微循環學雜志, 2015, 3: 1- 4.

[8] Hjertkvist M, Bergh A, Damber JE. HCG treatment increases intratesticular pressure in the abdominal testis of unilaterally cryptorchid rats [J]. J Androl, 1988, 9: 116- 120.

[9] Biagiotti G, Cavallini G, Modenini F,etal. Spermatogenesis and spectral echo-colour Doppler traces from the main testicular artery [J]. BJU Int, 2002, 90: 903- 908.

[10] Gandhi J, Dagur G, Sheynkin YR,etal. Testicular compartment syndrome: an overview of pathophysiology, etiology, evaluation, and management [J]. Transl Androl Urol, 2016, 5: 927- 934.

[11] Levy S, Serre V, Hermo L,etal. The effects of aging on the seminiferous epithelium and the blood-testis barrier of the Brown Norway rat [J]. J Androl, 1999, 20: 356- 365.

[12] Fan Y, Liu Y, Xue K,etal. Diet-induced obesity in male C57BL/6 mice decreases fertility as a consequence of disrupted blood-testis barrier [J]. PLoS One, 2015, 10: e0120775. doi: 10.1371/journal.pone.0120775.

[13] Fernandez CD, Bellentani FF, Fernandes GS,etal. Diet-induced obesity in rats leads to a decrease in sperm motility [J]. Reprod Biol Endocrinol, 2011, 9: 32- 42.

[14] Morgan DH, Ghribi O, Hui L,etal. Cholesterol-enriched diet disrupts the blood-testis barrier in rabbits [J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2014, 307: E1125- 1130.

[15] Foster RR, Armstrong L, Baker S,etal. Glycosaminoglycan regulation by VEGFA and VEGFC of the glomerular microvascular endothelial cell glycocalyx in vitro [J]. Am J Pathol, 2013, 183: 604- 616.