Treg在亞急性甲狀腺炎發病免疫機制中的作用

王小玲，呂合作，甘懷勇，項 平，張小鳳，徐二琴，裴曉艷，金國璽*

(蚌埠醫學院第一附屬醫院 1.內分泌科；2.檢驗科；3.病理科；4.中心實驗室；5.蚌埠醫學院診斷學教研室， 安徽 蚌埠 233004)

亞急性甲狀腺炎(subacute thyroiditis, SAT)是一種病因及發病機制未明的疾病，特征性的表現為甲狀腺部位的疼痛和壓痛，一般認為其與病毒感染及免疫因素有關，可能為病毒感染后出現了免疫機制異常。SAT的甲狀腺損傷似乎是細胞毒性T細胞識別病毒與宿主細胞膜抗原復合物的結果，細胞免疫反應可能在SAT的發病機制中發揮重要作用[1]。調節性T細胞(regulatory T-lymphocytes，Treg)在多種自身免疫性疾病的發生中起著重要的作用，它能夠釋放白細胞介素- 10(interleukin- 10，IL- 10)和轉化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)來抑制T細胞及抗原呈遞細胞的功能，降低炎性反應及抗體的產生，發揮免疫抑制效應。叉頭蛋白3(Foxp3)作為Treg的特異性標志分子，在其調節免疫自穩中起著關鍵的作用。前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)是一種炎性致痛因子，能抑制成纖維細胞的增殖分化及膠原的合成，對腫瘤壞死因子α和TGF-β致炎致纖維化產生負性影響[2]。本研究擬通過檢測外周血中Treg的比例、炎性反應因子的水平以及SAT組織中Treg的分布情況，以探討Treg在SAT發病的免疫機制中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣本：用于Treg及細胞因子檢測的SAT外周血為2016年1月至2016年12月在蚌埠醫學院第一附屬醫院內分泌科門診及住院部收集，均為初發患者，且半年內未使用影響免疫的藥物。SAT 46例，男13例，女33例，年齡范圍26～67歲，平均年齡(46.9±8.6)歲。對照組15名，為同期于體檢中心收集的外周血標本，男4名，女11名，年齡范圍27～62歲，平均年齡(43.4±11.8)歲。

用于Foxp3檢測的SAT及對照者甲狀腺標本分別來源于蚌埠醫學院第一附屬醫院外科手術的SAT甲狀腺組織和甲狀腺腺瘤瘤旁正常甲狀腺組織，均為石蠟包埋保存，并經病理確診。其中，SAT 29例，男6例，女23例，年齡范圍29～62歲，平均年齡(46.7±7.7)歲。對照組20名，男4名，女16名，年齡范圍32～64歲，平均年齡(47.37±9.7)歲。

所有SAT病例均經臨床表現、實驗室檢查、查體及影像學檢查等確診。符合2007年中國甲狀腺疾病診治指南中SAT的診斷標準[3]。標本采集已獲得蚌埠醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準及受試者知情同意。

1.1.2 主要試劑：Treg檢測試劑盒(Anti-CD25-FITC、Anti-CD4-PerCP、Anti-CD127-PE及IgG1-FITC,BD公司)；小鼠抗人Foxp3單克隆抗體[236A/E7](Abcam公司)；EnVision試劑盒(邁新試劑公司)；ELISA試劑盒(IL- 10、TGF-β1及PGE2，Elabscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 甲狀腺功能、ESR及CRP的檢測：用化學發光法檢測甲狀腺功能，用魏氏法檢測血沉(erythrocyte sedimentation rate, ESR)，用速率散色比濁法檢測C反應蛋白(C reactive protein, CRP)。

1.2.2 外周血Treg比例的測定：清晨收集EDTA-K2抗凝血標本2 mL，6 h內進行流式細胞術測定。取2只試管，管1加入Anti-CD4-PerCP及IgG1-FITC各20 μL，管2加入Anti-CD4-PerCP和Anti-CD25-FITC各20 μL及Anti-CD127-APC 5 μL，2管分別加入全血100 μL混勻，置于35 ℃水浴箱避光孵育15 min；加入FACSLysing溶血液2 mL，水浴箱中避光孵育10 min；1 800 r/min離心5 min，棄上清；加入PBS 1 mL，1 800 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS 1 mL，行流式細胞儀檢測。以前向和側向散射熒光設門，獲取淋巴細胞，分析CD4+T細胞占淋巴細胞的比例。再獲取CD4+T細胞，分析CD4+CD25+T細胞及CD4+CD25+CD127-Treg所占的比例。

1.2.3 外周血血清IL- 10、TGF-β1和PGE2的濃度測定：肝素鈉抗凝管留取空腹血3 mL，1 000×g離心15 min得上清后置于-80 ℃冰箱凍存。分別用IL- 10、TGF-β1和PGE2的ELISA檢測試劑盒對血清進行測定，嚴格按照說明書操作。

1.2.4 甲狀腺組織中Foxp3表達的測定：多聚甲醛固定新鮮甲狀腺組織，石蠟包埋；用HE染色及EnVision免疫組化染色法染色。切片機進行厚度4 μm切片，脫蠟，水化；抗原修復，高壓鍋沸騰2 min，自然冷卻；過氧化物酶試劑阻斷；1∶100配置小鼠抗人Foxp3單克隆抗體試劑，并滴加至玻片上；37 ℃恒溫培養箱培養1 h；滴加酶標羊抗小鼠IgG聚合物；DAB顯色2～3 min；蘇木精復染液復染；脫水后封片劑封固。

判斷標準[4]以光鏡下淋巴細胞核出現棕黃色顆粒為Foxp3陽性細胞，以高倍鏡不重復視野Foxp3陽性細胞數為判定標準，每個標本選擇5個高倍視野，取平均值，平均值≤3為陰性，>3為陽性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 甲狀腺功能、ESR及CRP比較

SAT組TT3、TT4、FT3和FT4均高于對照組，TSH低于對照組，ESR和CRP高于對照組(P<0.05)(表1)。

2.2 SAT患者外周血Treg比例

SAT組CD4+CD25+CD127-Treg比例明顯低于對照組(P<0.05)(表2，圖1)。

2.3 血清中細胞因子IL- 10、TGF-β1和PGE2的濃度比較

SAT組血清中TGF-β1濃度明顯高于對照組(P<0.05)(表3)。

2.4 甲狀腺組織中Foxp3蛋白的表達

SAT組甲狀腺組織中有Foxp3蛋白表達，細胞核染色表現為黃褐色顆粒，呈分散分布，少數灶性分布，與淋巴細胞浸潤多少有關，且分布于T細胞分布區域。而甲狀腺腺瘤組織及腺瘤旁正常甲狀腺組織基本無Foxp3蛋白表達，僅少數病例表達陽性。SAT組Foxp3蛋白陽性率為72.41%，明顯高于腺瘤組及對照組(P<0.0125)(表4, 圖2)。

3 討論

研究證實，SAT患者循環中存在直接針對TSHR的抗體，并證實存在針對甲狀腺抗原的致敏T淋巴細胞[5]。一些針對免疫系統的新療法會導致SAT，提示有免疫因素參與其中[6]。目前已知Treg在體內能夠發揮免疫抑制作用，維持自身耐受及抑制抗腫瘤免疫反應。Treg的數量異常及功能缺陷在多種疾病的發病中起了重要的作用，如Graves病(Graves disease，GD)、丙型肝炎病毒(HCV)和橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis，HT)等。Graves病患者體內存在Treg數量減少或者功能的缺陷[7]。恢復期HCV慢性病患者的Treg數量與持續感染有關，其比例顯著增加能夠抑制HCV特異的CD8+T細胞[8]。人Treg可抑制T細胞對HIV和巨細胞病毒的抗原特異性免疫應答[9]。推測，慢性病毒感染將引起抑制抗病毒免疫的Treg產生。但是，Treg在SAT發生發展中的變化及意義如何?至今沒有相關的研究報道。TGF-β1、IL- 10和PGE2均可誘導初始T細胞轉化為Treg并表達Foxp3，在維持和增強Treg的免疫抑制作用中起著重要的作用[10- 12]。為探討SAT發病中Treg轉化率的變化以及影響Treg 轉化的細胞因子的相應變化，進行了相關研究。

表1 SAT組與對照組甲狀腺功能、ESR及CRP的比較Table 1 Comparison of thyroid function, ESR and CRP between SAT group and control group(±s)

*P<0.05 compared with control group.

表2 SAT組與對照組外周血Treg比例的比較Table 2 Comparison of proportion of Treg in peripheral blood between SAT group and control group(±s,%)

*P<0.05 compared with control group.

A.the proportion of CD4+CD25+T cells of SAT group; B.the proportion of CD4+CD25+T cells of control group; C.the proportion of CD4+CD25+CD127-Treg of SAT group; D.the proportion of CD4+CD25+CD127-Treg of the control group

圖1 SAT組與對照組外周血Treg比例的比較Fig 1 Comparison of proportion of Treg in peripheral blood between SAT group and control group

*P<0.05 compared with control group.

表4 SAT組、腺瘤組及對照組甲狀腺組織中Foxp3蛋白的表達

#P<0.0125 compared with adenoma group;*P<0.0125 compared with control group.

實驗結果顯示，SAT組患者外周血中Treg明顯降低。Treg降低后，免疫抑制作用減弱，易出現免疫紊亂。血漿中TGF-β1水平明顯升高， 與外周血Treg減少相互矛盾，這在GD和HT中亦可見，可能與TGF-β1反饋性升高有關，以誘導CD4+CD25-T細胞轉化為CD4+CD25+T細胞，減輕自身免疫反應[13]。

A.thyroid tissue of SAT; B.thyroid tissue of adenoma; C.thyroid tissue adjacent to adenoma圖2 SAT組、腺瘤組及對照組甲狀腺組織中Foxp3蛋白的表達

SAT組患者甲狀腺組織中Foxp3蛋白表達明顯增多，此與血液中Treg減少相悖，這在HT中亦曾被報道[14]，可能為甲狀腺產生免疫破壞后，血液中的Treg轉移到甲狀腺組織，從而增強病變部位的免疫抑制作用，以調節免疫機制紊亂。

推測SAT發病的機制可能為病毒感染誘發了免疫機制異常，Treg減少，對T細胞及抗原呈遞細胞的抑制作用減弱，1型T輔助細胞與細胞毒性T細胞活性增高，破壞甲狀腺濾泡，導致SAT的發生[1,15]。本研究證實，Treg減少可能是SAT發病的始動因素，當免疫炎性反應劇烈時，可伴有代償性的TGF-β1升高，至于TGF-β1升高以后會不會及時地上調Treg的分化和成熟，產生免疫保護作用及其在SAT轉歸中的作用機制，是下一步的研究方向。

[1] Kojima M, Nakamura S, Oyama T,etal. Cellular composition of subacute thyroiditis. An immunohistochemical study of six cases[J]. Pathol Res Pract, 2002, 198: 833- 837.

[2] 龍翔, 熊盛道, 熊維寧, 等. 前列腺素E_2抑制轉化生長因子-β1誘導的人胚肺成纖維細胞轉分化及膠原合成[J]. 中國病理生理雜志, 2008， 24: 925- 930.

[3] 滕衛平, 曾正陪, 李光偉. 中國甲狀腺疾病診治指南[J]. 中華內科雜志, 2007, 46: 876.

[4] 趙紋蕓, 沈坤煒, 包家林, 等. Foxp3在乳腺癌組織中的表達及其臨床意 義[J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2011, 18: 533- 538.

[5] 廖二元, 莫朝輝, 張紅, 等. 內分泌與代謝性疾病上冊[M]. 第3版. 北京:人民衛生出版社, 2012: 497.

[6] 曲衛, 李美曄, 王靜, 等. 注射甲型H1N1流感疫苗引起亞急性甲狀腺炎1例報告[J]. 標記免疫分析與臨床, 2014,21: 489- 491.

[7] 何珂, 胡蘊, 毛曉明. Graves病患者外周血免疫調節細胞及其亞群比例異常[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2014, 30: 1190- 1193,1197.

[8] Sugimoto K, Ikeda F, Stadanlick J,etal. Suppression of HCV-specific T cells without differential hierarchy demonstratedexvivoin persistent HCV infection[J]. Hepatology, 2003, 38: 1437- 1448.

[9] Aandahl EM, Micha?lsson J, Moretto WJ,etal. Human CD4+CD25+regulatory T cells control T-cell responses to human immunodeficiency virus and cytomegalovirus antigens[J]. J Virol, 2004, 78: 2454- 2459.

[10] Murai M, Turovskaya O, Kim G,etal. Interleukin 10 acts on regulatory T cells to maintain expression of the transcription factor Foxp3 and suppressive function in mice with colitis[J]. Nat Immunol, 2009, 10: 1178- 1184.

[11] Liu Y, Zhang P, Li J,etalA critical function for TGF-beta signaling in the development of natural CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells[J]. Nat Immunol, 2008, 9: 632- 640.

[12] Karavitis J, Hix LM, Shi YH,etal. Regulation of COX2 expression in mouse mammary tumor cells controls bone metastasis and PGE2-induction of regulatory T cell migration[J]. PLoS One, 2012, 7: e46342. doi: 10. 1371/journal. pone. 0046342.

[13] 鄭領濤, 于世鵬, 王娜, 等. 調節性T細胞和TGFβ_1在自身免疫性甲狀腺疾病中的作用[J]. 山東醫藥, 2012, 52: 81- 82.

[14] 王榮, 張健, 秦秋, 等. Foxp3在自身免疫性甲狀腺病患者外周血和病變組織中的表達[J]. 西安交通大學學報:醫學版, 2012, 33: 56- 60.

[15] Kramer AB, Roozendaal C, Dullaart RPF. Familial occurrence of subacute thyroiditis associated with human leukocyte antigen-B35[J]. Thyroid, 2004, 14: 544- 547.