腫瘤抑制基因PAQR3在肺癌中表達水平降低

燕 杰，蔣 琪

(天津醫學高等專科學校， 天津 300222)

在全球范圍內，肺癌是發病率和病死率增長最快、對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，肺癌分別占男性和女性癌癥的17%和9%[1]，造成了約19%的癌相關死亡。深入了解肺癌的發生發展機制，尋找新的治療靶點，對于肺癌的早期發現和診斷以及提高治療效果有著非常重要的意義。有報道，孕激素和脂聯素分子受體3(progestin and adipoQ receptor 3，PAQR3)在前列腺癌、結直腸癌、乳腺癌和胃癌等多種腫瘤中表達降低[2- 3]，而且在腫瘤形成、生長和轉移等過程中發揮了抑制作用。但是，關于PAQR3在肺癌中的相關研究還比較少。因此，本文對肺癌組織中PAQR3的表達情況進行了檢測和分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例:選取40例不同年齡、不同性別已經接受過外科手術，但未接受過任何放療和化療的肺癌患者的肺癌組織和癌旁組織石蠟標本，收集標本時間為2015-2016年，其中男26例，女14例；年齡42～78歲，平均年齡55.6歲。

1.1.2 試劑:PAQR3和β-actin引物(上海生工生物工程股份有限公司)，總RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒(Thermo Scientific公司)，UltraSYBR Mixture(北京康為世紀生物科技有限公司)，PAQR3抗體(Abcam公司)，β-actin抗體和二抗(博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 Real-time RT-PCR檢測PAQR3 mRNA表達:取50 mg組織，在研缽中研磨，研磨期間不斷加入液氮，隨后提取總RNA，NanoDrop2000測定RNA濃度及A260/A280比值(1.8～2.0)后進行反轉錄。設計real-time RT-PCR引物，并通過NCBI blast檢測其特異性。PAQR3引物：5′-AACCCGTACAT CACCGACG-3′(F)，5′-TCTGGACGCACTTGCTGAAG-3′(R)；β-肌動蛋白(β-Actin)引物：5′-CATGTACGTTGCTATC CAGGC-3′(F)，5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′(R)。反應體系50 μL：2×UltraSYBR Mixture 25 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，雙蒸水21 μL。反應條件：95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s。

1.2.2 Western blot檢測PAQR3蛋白表達:取50 mg組織，勻漿后提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，取等量蛋白采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白并轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，4 ℃孵育一抗過夜，洗去一抗以辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗室溫孵育2 h，洗滌后使用Tanon 5200全自動化學發光圖像分析系統曝光成像，分析結果，β-actin作為內參。

1.3 數據統計:采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析。實驗結果用均數±標準差表示。配對的肺癌和癌旁組織樣本的實驗結果以及GSE18842芯片數據通過配對樣本的t檢驗進行分析。

2 結果

2.1 肺癌組織中PAQR3 mRNA的表達情況:40例樣本中有36例(90%)肺癌組織中PAQR3 mRNA的表達水平降低，明顯低于對照組(8.53±0.96 vs 10.28±1.61)(P<0.001)。

2.2 肺癌組織中PAQR3蛋白的表達情況:與癌旁組織相比，肺癌組織中PAQR3蛋白的表達水平降低(P<0.01)(圖1)。

2.3 GEO數據分析:在NCBI GEO數據庫芯片GSE18842中包含44個配對的非小細胞肺癌與癌旁組織，在癌組織中PAQR3基因mRNA的表達水平顯著低于癌旁組織(3.39±0.13 vs 3.47±0.17)(P<0.05)。

3 討論

PAQR3是孕酮和脂聯素受體(PAQR)家族中的一員，人PAQR3基因定位于染色體4q21.21，其編碼的蛋白分子質量大小約37 ku。PAQR3被報道可以將細胞質中的Raf- 1錨定至高爾基體， 阻斷EGF刺激的Raf- 1膜轉位， 降低Raf- 1與Ras和MEK1的相互作用，對Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的活化起到了阻斷的作用，從而抑制肝癌的生長。

N.cancer ajacent tissues; T.cancer tissues; *P<0.01 compared with cancer ajacent tissues圖1 PAQR3在肺癌組織及癌旁組織中的蛋白表達水平Fig 1 The expression level of PAQR3 protein in lung cancer tissues and adjacent normal tissues(±s, n=3)

本研究發現，PAQR3在肺癌組織中的mRNA和蛋白表達水平均明顯低于癌旁組織，PAQR3的低表達可能在肺癌的發生發展過程中發揮了一定的作用。研究報道[4]，DNA損傷結合蛋白2(damage-specific DNA-binding protein 2，DDB2)可能參與了PAQR3的泛素化和降解，這可能是PAQR3表達降低的機制之一。

總之，PAQR3在肺癌組織中呈明顯低表達，但其表達水平降低和發揮作用的具體機制還有待于進一步研究，來為闡明肺癌的發生發展規律提供幫助，為肺癌的診斷和治療提供新的思路。

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL,etal. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65: 87- 108.

[2] Qiao S, Guo W, Liao L,etal. DDB2 is involved in ubiquitination and degradation of PAQR3 and regulates tumorigenesis of gastric cancer cells[J]. Biochem J, 2015,469: 469- 480.

[3] Li RH, Zhang AM, Li S,etal. PAQR3 gene expression and its methylation level in colorectal cancer tissues[J]. Oncol Lett,2016,12: 1773- 1778.

[4] Guo W, You X, Xu D,etal. PAQR3 enhances Twist1 degradation to suppress epithelial-mesenchymal transition and metastasis of gastric cancer cells[J]. Carcinogenesis,2016,37: 397- 407.