單個等離子體納米顆粒在生化分析和生物成像中的應用

雷剛，何彥

1 引言

眾所周知，等離子體納米顆粒(PNPs)因其獨特的局域表面等離子共振(LSPR)吸收和散射而展現出優良的光學性質1。近年來，PNPs的光散射性質得到了越來越多的關注，并逐漸被應用于分析化學領域2。在光散射分析化學的初期，研究者們主要利用溶液中大量納米顆粒的平均散射信號來進行定量分析3,4，盡管這種分析方法快速、簡便且檢測范圍廣泛，但其在靈敏度和準確度方面必然存在一定的局限性。暗場顯微鏡(DFM)的出現促進了單個 PNPs的 LSPR光散射性質方面的研究，也為實現單納米顆粒水平上的分析提供了可能5-7。PNPs的LSPR散射光對周圍介質環境非常敏感，有機小分子和生物大分子的吸附以及化學反應都能夠引起PNPs表面介質環境的變化，從而使其 LSPR散射光譜發生相應的移動，因此，單個 PNPs可以作為彼此獨立的光散射探針用于分子檢測以及其它相互作用的分析。

作為一種具有超高靈敏度的檢測技術，單分子光譜(SMS)技術自被建立以來就受到大量關注，并于近十年間得到迅猛的發展8，為分析化學開啟了一扇全新的大門。SMS技術是考察復雜細胞系統內動力學變化及物質相互作用的強有力方法。不同于以大量分子長時間內的平均行為為信號來源的傳統分析方法，SMS技術可以實現對溶液中單個分子的檢測與實時成像，從而排除宏觀測量對系統復雜性造成的簡化，發現隱藏在整體平均中的個體差異，捕捉淹沒于宏觀測量的極少數的中間體或過渡狀態，追蹤被掩蓋在平衡狀態之下隨時間和空間變化著的微觀動力學過程。目前，相對成熟的SMS技術大都是以熒光分子或者半導體量子點為探針的熒光成像技術9，如激光共聚焦、全內反射熒光等等。但是，傳統的熒光小分子和蛋白光穩定性差，且光強度較弱，而半導體量子點又存在有細胞毒性較大且難以進行特定修飾等缺點10。這些問題一方面推動著開發新型熒光探針的研究，另一方面促進著非熒光標記單分子成像技術的建立。與熒光探針相比，PNPs易于修飾、生物兼容性好，且其 LSPR散射光具有強度高、穩定性好及持續性長等優點。因此，發展以PNPs為探針的單分子成像技術對化學傳感、生物成像與生物納米技術的重要性不言而喻。

單個PNPs的成像主要基于其LSPR吸收和散射特性，如微分干涉相差(DIC)成像和暗場成像。由于DIC圖像對比度不高，從中難以區分探針和各種亞細胞結構，所以大多數關于成像單個PNPs的報道都是以暗場成像為手段的。暗場成像技術是一種以所測樣品的散射光為信號在較低背景下進行成像的技術，通過與光譜儀聯用，該技術還可用于獲取單個顆粒的LSPR光譜11。目前，常見的DFM主要利用高數值孔徑聚光鏡產生斜照明，在空間上實現對入射光與所測樣品散射光的信號分離，從而產生極高的對比度。用暗場成像技術拍攝的細胞圖像背景暗樣品亮，其對比度甚至可以與熒光圖像媲美。但是，傳統的DFM也存在分辨率不高、光學切割能力較弱和背景干擾大等缺點。通過對光源、檢測器及其它光學元件的擇優組裝和調試，我們開發出了一系列具有高靈敏度、高時空分辨率和高通量的暗場成像技術，并采用經可控合成篩選出的單分散單個PNP探針，將這些技術巧妙地應用于單分子檢測、多顆粒傳感、生物過程示蹤以及單細胞成像等領域。除此之外，我們還以具有光學各向異性的PNPs為探針，研制出精確的活細胞三維掃描成像系統和激光暗場高速毛細管電泳聯用系統，為高效率的儀器偶聯提供參照。這些技術有望將單分子光譜技術的發展推向一個全新的高度。

2 PNPs的合成

PNPs的LSPR性質與其自身的組成成分、大小和形狀等有著密切的關系，為了篩選出合適的PNP探針，已有許多研究深入探討了各種 PNPs的可控合成方法，如利用DNA介導及電置換反應等12-14。由于銀和金納米顆粒(AgNPs和 AuNPs)的吸收和散射信號主要集中在近紫外-可見-近紅外光區，且強度較高，所以其已成為最常用的PNP探針15,16。相對于 AgNPs，AuNPs因為具有更穩定的光學性質和更低的細胞毒性而在生物成像中得到廣泛的應用。金納米棒(AuNRs)是最為典型的一個例子，其不僅能夠產生強而穩定的散射信號，而且具有起源于自身各向異性的光學偏振特性，因此，AuNRs作為一種非常理想的光學成像探針近年來得到研究者們的廣泛關注。AuNRs最早的制備是在含有十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的金離子溶液中通過硅或鋁的微孔中經電化學還原所實現的17，此方法得到的AuNRs雖有著一些特殊的光學特性，但是沒有明顯的 LSPR性質。2001年，Murphy課題組最先提出晶種生長法的概念18，他們將小 AuNPs作為晶種加入到含有氯金酸和CTAB的混合溶液中，通過多步生長法得到了長徑比可控的AuNRs19。然而，該方法的產率較低，而且樣品需要分離，較為繁瑣。在2003-2004年，很多研究小組研發了一種高產率的小長徑比AuNPs的合成方法，即使用外部有1.5 nm的CTAB保護的 AuNPs為晶種，并加入一定量的 AgNO3作為輔助20-22。該方法可以通過控制硝酸銀的量來調控AuNRs的長徑比，所制備的AuNRs的產率在 95%以上。由于操作簡單、重復性高且易于調控，這種銀離子輔助的晶種生長法是目前使用最多的AuNRs制備方法。鑒于要經常使用單分散且均一的AuNRs作為生物成像和系統性能測試的探針，我們基于晶種生長法系統地研究了AuNRs的合成，發現pH值不僅能改變還原劑抗壞血酸的還原能力，還能改變CTAB分子在金表面的吸附能力以及CTAB雙分子層膠束的形狀和大小，并最終改變合成產物的形狀23。在此基礎上，我們又發現除了常用的抗壞血酸，亞硝鈉和氯化鐵在酸性條件下都可以作為溫和的還原劑對AuNRs的長徑比進行精確的調控24，相較于可控合成，這種利用刻蝕反應調節AuNRs的LSPR性質以得到滿足條件的探針的方法更為簡便。此外，我們還發現在堿性條件下用雙氧水作還原劑可以合成小尺寸的AuNRs，彌補了在堿性條件下合成AuNRs的空缺25。由于無論采用哪種方法合成AuNRs都不可避免地會得到包含有各種長徑比的AuNRs與具有其它形狀的AuNPs的混合物，為了獲得單分子成像必需的均一的AuNRs探針，我們發展了一種簡便的、基于梯度分離法分離純化AuNRs的新方法26。

在諸多 PNPs之中，AuNPs的生物兼容性最好，但是其它金屬也有著金所不具備的優異性能，比如銀的氧化活性，鉑的催化性能等27,28。因此，合成具有核殼結構的金與其它金屬的復合納米材料可能會降低其它金屬的細胞毒性，從而使其特殊的性能可以在應用于生物體內的研究體系中得到施展，我們課題組也開展了一些這方面的工作。最近的研究表明，活性氧系列分子(ROS)的生成與累積能夠引起細胞的氧化性損傷，這也是紫外線照射引起細胞損傷的主要途徑之一。因此，清除細胞內的ROS以防止其累積對維護人體健康和防治疾病有著重要的意義。為了達到清除細胞內ROS的目的，我們制備了一種表面帶有刺狀鉑納米點的AuNRs，相較于的單純的鉑納米顆粒，這種復合納米材料表現出更好的生物兼容性和催化性能，實驗結果證明其能有效地催化分解細胞內的ROS從而緩解紫外線輻射所造成的細胞損傷29。我們還合成了金銀復合PNPs以實現細胞內的H2S傳感和調節探針顏色響應區間的目的，詳細的內容見下一節。

3 PNPs在生化分析中的應用

3.1 單分子檢測

由于在臨床診斷方面具有潛在的應用價值，基于 PNPs聚集引起光譜變化所建立的特定核酸序列的檢測和定量方法已經受到了大量的關注。如Alivisatos等所展示的那樣30，通過金―硫鍵把兩段核苷酸序列分別修飾到AuNPs表面之后，將含有與這兩段核苷酸序列互補的目標 DNA溶液與之混合，DNA的三明治雜交會使得AuNPs形成二聚體或者多聚體，從而允許研究者們通過AuNPs紫外吸收光譜的位移或者肉眼可分辨的顏色變化實現對DNA的檢測。這種比色檢測DNA的方法雖然簡便，但是存在靈敏度不高、難以定量和無法同時實現多靶物檢測等缺點。本課題組使用一個帶有真彩 CCD的 DFM，以單個顏色編碼的AuNPs為探針，發展了一種基于耦合顆粒計數的DNA檢測方法，這種方法能夠對多種目標分子同時進行動態檢測(圖1(a, b)，而且靈敏度極高，檢測下限達到0.02 pmol·L-1(圖1(c))31。但是，由于該方法需要將PNP探針固定在玻片上來進行計數，較為耗時，因此我們在后續工作中使用一個高亮度短脈沖的頻閃光源來代替顯微鏡標配的鹵鎢燈，利用改造后的 DFM (FLDM)對溶液中的AuNPs進行直接快速的計數，通過DNA雜交引起的AuNPs探針數量的減少與目標DNA濃度之間的線性關系實現了對目標DNA的檢測，從而解決了上述問題32。但是，依靠探針數量減少的方法在目標分子濃度很低時會存在較大的誤差。考慮到球形的PNPs是各向同性的，經線性偏振光照射之后，不能夠改變線性偏振光的振動方向，因此在起偏器與檢偏器垂直的情況下，檢測器無法收集到球形PNPs的光學信號。當球形PNPs發生聚集之后，其聚集體很不均一，具有很強的各向異性，因此能夠產生偏振散射信號。通過在之前的FLDM 上裝配起偏器和檢偏器，我們發展了一種基于頻閃光源的正交偏振DFM方法，由于檢測的是目標分子導致的可檢測探針顆粒的增加，大大提高了檢測的精密度33。該方法對硫化物有著0.1 nmol·L-1的檢測下限，且動態范圍跨越五個數量級。

圖1 利用顏色編碼的PNPs建立單分子檢測方法31Fig.1 Single molecule detection using color coded PNPs31.

3.2 多顆粒傳感

由于PNPs的LSPR散射光對自身性質及周圍環境的變化都非常敏感，因此發展能夠快速且高通量地獲取單個納米顆粒的 LSPR散射光譜的技術是非常必要的。傳統的基于光譜儀的單顆粒光譜成像技術通量較低，只能獲取狹長區域內少數顆粒的光譜，因為其必需要使用入射狹縫來排除背景光譜的干擾。在實現了高信背比單顆粒散射光成像的基礎上，我們通過去除入射狹縫，在顯微鏡檢測光路中加入透射光柵的方法，建立了一種能夠同時獲取多個單顆粒的散射光譜的技術。利用該技術，我們以單個AuNRs為探針實時觀察了H2O2氧化金的反應，并且通過實時分析多個納米顆粒的動態散射光譜，發現金納米棒在反應中會以自催化的方式加快反應的速率(圖2)34。

細胞內環境復雜，經常需要同時檢測不同區域的單顆粒光譜來監測細胞內某些物質的區域濃度。作為一種特殊的氣體信號分子，H2S在許多生物系統中具有重要的調控作用。采用這種高通量的單顆粒暗場光譜成像技術，我們以具有核殼結構的銀包金納米棒為探針，對細胞內硫化物的局部濃度進行了高靈敏地檢測。我們的方法基于對因形成硫化銀所導致的納米探針 LSPR光譜紅移的實時監測。特別地，我們發現單個金銀復合納米探針的光譜的變化與局部硫化物濃度以及在細胞內環境復雜，經常需要同時檢測不同區域的單顆粒光譜來監測細胞內某些物質的區域濃度。作為一種特殊的氣體信號分子，H2S在許多生物系統中具有重要的調控作用。采用這種高通量的單顆粒暗場光譜成像技術，我們以具有核殼結構的銀包金納米棒為探針，對細胞內硫化物的局部濃度進行了高靈敏地檢測。我們的方法基于對因形成硫化銀所導致的納米探針 LSPR光譜紅移的實時監測。特別地，我們發現單個金銀復合納米探針的光譜的變化與局部硫化物濃度以及在單個金納米棒表面生成硫化銀的反應速率直接相關，從而首次以 nmol·L-1靈敏度實現了針對活細胞內局域硫化物水平實時變化的高靈敏度、高選擇性和大動態范圍的檢測(圖 3(a-e)35。雖然采用透射光柵能夠一次性地獲得多個納米顆粒的光譜，但是提取這些光譜卻要耗費大量的時間，為此，我們建立了一種通過跟蹤直觀易確認的顏色變化來更為簡便地獲取多個顆粒的光譜變化信息的方法。由于顏色響應的敏感區間主要位于可見光黃綠光區(530-590 nm)，我們通過用金銀核殼球形納米顆粒取代金銀核殼棒狀納米顆粒，把納米顆粒探針的響應區間調整至顏色檢測最敏感的區間，從而能夠利用探針的顏色變化同時監測大量顆粒對局域H2S的響應，實現了更為簡便的高通量的多顆粒硫化物傳感(圖3(f-h)36。根據顏色的形成機制，顏色并非一種可以測量的客觀物理量，而是一種主觀感覺。盡管人們能夠對事物的顏色形成共識，但同一物體采用同一檢測器，其顏色表現都會因照明光源的不同而產生顯著差異。通過激光照明工程技術，采用多束窄帶光源的組合，我們發展了基于彩色CCD三基色分光的PNPs散射光檢測技術。該技術可以把顏色分辨能力提高一個數量級，使光譜差異較小、在白光下無法區分的AuNPs呈現出明顯的顏色差異，從而實現納米金粒徑以及團聚解團聚的高靈敏可視化檢測37。

圖2 實時監測單個AuNRs的氧化動力學過程34Fig.2 Real-time monitoring the dynamic oxidation process34.

圖3 體內外的高通量硫化物傳感35,36Fig.3 High-throughput sulfide sensing in vitro and in vivo35,36.

4 基于PNPs的單細胞成像

當PNPs應用于單細胞成像時，由于細胞內環境復雜，存在極大的背景干擾，因此如何提高成像的信噪比以及如何區分納米顆粒是在細胞膜上還是細胞內部一直是一個亟待解決的問題。此外，盡管 PNPs常被用作光散射探針以實時示蹤細胞內的一些生命活動和代謝過程38,39，但是其進入細胞的途徑及原理一直以來都未得到進一步的揭示。本課題組長期開展了有關細胞內納米顆粒高分辨成像以及納米顆粒與細胞相互作用方面的研究，在此過程中研發出不少能夠示蹤納米顆粒在運動過程中的三維角度變化、實現突破衍射極限的超分辨成像和活細胞三維掃描成像等技術，這些先進的成像系統將為單細胞成像方面的研究提供有力的幫助。

4.1 基于雙偏振成像檢測單個AuNR的三維取向

要考察單個納米顆粒在液固表面的運動行為，不僅需要實時跟蹤單個納米顆粒的平移運動，還需要準確地知曉它們的三維角度，而傳統的暗場成像技術顯然不能提供這些信息。為此，我們發展了基于雙通道偏振成像檢測單個AuNR三維空間取向的技術。該技術的原理是把具有特定傳播方向的入射光照射到含有AuNRs的樣品上，由于AuNRs的長軸方向與入射光之間存在著可用數學方程準確描述的平面角與極化角，其產生的散射光信號號會同時包含具體的三維角度信息。通過在檢測光路中加入一塊雙折射晶體，就可以同時獲取該AuNR在兩個正交偏振方向上的散射光總強度和相對強度，從而推算出其平面角與極化角的大小。我們通過理論和實驗證明平面照明模式和環形照明模式都可以獲取AuNRs的三維空間取向。采用該技術，我們考察了單個AuNR跨越細胞膜進入細胞的全過程，獲得了該重要生物學行為的大量細節信息(圖 4)40。此外，我們還考察了牛血清蛋白修飾的單個 AuNR與 C18修飾的玻片表面在色譜流動相淋洗過程中的相互作用，發現二者之間不是簡單的吸附與解吸附的關系，而是包含了許多復雜的動力學狀態(圖5)41。

4.2 單個細胞的高分辨成像及三維掃描成像

有多種方法可以實現三維熒光成像，但其前提都是在接近零背景的情況下對熒光探針分子進行選擇性的識別42。但是，由于檢測波長與照射波長相同，以AuNPs為探針的共振光散射成像不能使用波長濾光片來消除背景瑞利散射的干擾。我們開發了一種雙波長差異成像方法來解決這個問題43。如圖6(a, c)所示，在波長分別為473 nm和532 nm的激光照射下，純的細胞溶解產物的雙通道圖像幾乎沒有表現出強度的變化。相比之下，純的AuNPs的雙通道圖像則展現出很大的強度變化(圖6(b, d)。基于此，我們可以通過雙波長成像模式下強度差異的大小來有效地區分活細胞中的細胞背景與AuNP探針，實現對單個小AuNP探針的高靈敏檢測(圖6(e, f)。

圖4 直接成像單個AuNR的跨膜動力學過程40Fig.4 Direct imaging of transmembrane dynamics of single gold nanorod40.

圖5 直接觀察液固表面上單個蛋白質包被的納米顆粒的方向動力學41Fig.5 Direct observation of the orientation dynamics of single protein-coated nanoparticles at liquid/solid interfaces41.

圖6 活細胞中PNPs的無背景雙波長差異成像43Fig.6 Noise-free dual-wavelength difference imaging of plasmonic resonant nanoparticles in living cells43.

為了實現高分辨暗場成像，我們還采用正交偏振光檢測技術，基于AuNRs的LSPR散射光強度對其空間取向的敏感性建立了對各向異性AuNPs進行準確定位和超分辨成像的新方法。正交偏振成像可以有效地消除來自球形納米顆粒、玻璃基底和細胞內部的瑞利散射光背景(圖7)。我們證明該技術可實現對單個AuNRs 15 nm的定位精度和水平方向上最小80 nm左右的分辨率44。除此之外，當采用高數值孔徑的物鏡鏡頭時，通過使用一個步進旋轉電機來精確地控制 Z方向上的距離，該技術還可以對單個AuNRs進行選擇性地三維成像，從而實現細胞內AuNR探針三維分布的高分辨定位45。

4.3 探究單個PNPs與細胞外環境的相互作用

采用傳統的單分子暗場成像技術，我們實時原位觀察了50-130 nm的AuNPs與癌細胞的相互作用。在AuNPs被癌細胞內吞的過程中，它們在以擴散的方式到達細胞膜之前經歷了一個明顯的減速過程。通過光學切割，我們發現這層能夠減慢AuNPs運動的細胞外周介質厚度大約為3-20 μm46。進一步的研究表明，這個以前被人們所忽略的、在光學顯微鏡下很難觀察到的介質層其實是以多糖聚合物透明質酸為主要成分的細胞膜外基質(PCM)，它是細胞個體的緩沖區，對細胞外納米顆粒的捕獲和內吞有重要影響。當PCM存在時，AuNPs被細胞捕獲和內吞的數量較多；但當PCM被溶解掉之后，AuNPs被細胞捕獲和內吞的數量就相對較少(圖8)。通過對單個納米顆粒的實時示蹤，我們發現PCM的主要作用是“緩沖減速”，即把在一定尺寸范圍內(50-200 nm)的AuNPs的擴

散速率，都調整到與細胞膜上蛋白受體的擴散速率相接近的水平，即0.1 μm2·s-1，從而有利于受體與AuNPs的結合，這表明PCM似乎具有某種程度的主動性。不僅如此，我們還發現能夠抑制細胞內吞納米顆粒的條件和試劑也同時會抑制PCM對納米顆粒的捕獲。所有這些結果意味著細胞內吞納米顆粒這一重要生理功能是由以細胞膜為核心，包括細胞骨架和PCM在內的多種細胞內外結構共同完成的，是亞細胞層面上的一層精巧的自組織行為，這對于我們加深對細胞整體功能的認識具有深刻的意義47,48。

4.4 活細胞中機械力轉導過程的可視化

圖7 基于各向異性PNPs的亞衍射極限成像44Fig.7 Subdiffraction-limited imaging based on anisotropic PNPs44.

圖8 細胞膜外基質對納米顆粒滯留和攝取的增強效應47Fig.8 Pericellular matrix enhances retention and cellular uptake of nanoparticles47.

活細胞中的機械力信號被視為諸多生理功能的生物學基礎，想要更好地理解這些過程的本質，就要對活細胞內的局域機械力轉導的動力學過程進行成像和測定。通過合成以彈性分子PEG連接的兩個金納米顆粒構成的納米彈簧為探針，我們利用暗場光譜成像技術對納米彈簧因受細胞骨架的收縮或伸展的影響而產生的光譜變化進行實時監測，從而可視化了活細胞中由外加刺激信號觸發的細胞膜上局域機械力的轉導活動49。如圖9(ac)所示，納米彈簧的一端與玻片底部相連，另一端通過抗體與細胞膜上特定受體相連，當細胞因外部刺激而產生不均勻的收縮或伸展時，一對納米彈簧中兩個納米顆粒之間的距離也會隨之改變，從而導致兩者之間的等離子耦合效應的強度變化，根據納米彈簧LSPR散射光譜變化的大小就可以得出實時的生物機械力大小。圖9(d)展示了在ROS刺激下活細胞中不同區域和不同時間段內的機械力信號變化。我們預期該策略也適用于探測活體組織中其它方式的機械力信號傳導與調節。

5 單層照明暗場成像與微通道檢測聯用系統的構建

我們在傳統的暗場及光片照明顯微鏡的基礎上，通過對光源、檢測器以及其它光學元件的選擇和優化，開發出一套具有高靈敏度、高信噪比、高時空分辨率以及高各向異性分辨率的激光單層照明暗場成像體系，如圖10所示。整個顯微系統通過直接利用超連續白光激光光片照射樣品的方式來進行暗場散射成像，由此獲取納米探針的數目、散射光顏色、光譜和強度等信息，為單個顆粒的實時動態監測提供了一種全新的研究方法。比如，利用所搭建的激光單層照明暗場成像系統，結合毛細管-缺口管陣列進樣系統，我們考察了單個AuNRs在氧化過程中的動力學行為，通過分析其電遷移率、散射光顏色、光譜和強度等變化信息的變化趨勢，我們發現表面帶有不同修飾物的AuNRs的氧化行為之間的差異以及AuNRs在氧化過程中表面所帶的電荷總量的變化，進一步地揭示了AuNRs氧化的反應機理50。

圖9 活細胞中局域機械力轉導的可視化49Fig.9 Visualization of localized mechanical force transduction in live cells49.

圖10 用于毛細管電泳檢測的超連續激光單層照明暗場成像系統的搭建原理50Fig.10 Schematic of the supercontinuum laser light-sheet plasmonic imaging system for capillary electrophoresis detection50.

6 總結與展望

PNPs因為具有優異的光學性質、催化性能和生物兼容性而逐漸從基礎科學研究走向實際應用之中，其在功能材料、化學傳感、生物醫藥和光學成像等領域已經得到了廣泛的應用。PNPs的LSPR響應對周圍環境極其敏感，這也使得我們能夠利用其消光或散射光譜的變化對一些有害的物質進行檢測。值得注意的是，暗場成像技術的應用和優化在最佳條件下可使視野中的每一個PNP都能夠作為單獨的傳感器，這種以單個PNPs的LSPR散射光為信號的分析手段因具有常規方法難以企及的靈敏度和高通量而備受關注，具有非凡的發展空間。現有的熒光探針，包括最近興起的碳納米點，都存在光穩定性差或光信號較弱等缺點，相比之下，PNPs的散射光強度很高且非常穩定，更重要的是每一個PNPs都可以作為單獨的探針而對樣品的不同區域進行成像，使得我們能夠實時原位長時間地觀測同一樣品中的多個區域。因此，基于PNPs的單分子光譜成像技術必將在復雜體系的成像領域中得到越來越多的重視。特別地，在近來非常活躍的活體組織和智能材料研究中，單個PNP的大小相比于材料自身的尺寸基本上可以忽略不計，從而更能夠客觀地反映出材料內部的結構和功能信息。此外，目前常用的單顆粒PNP探針多為金銀納米顆粒或其復合材料，很少有研究用到其它PNPs，因此該領域還有很大的發展前景，采用除金銀納米顆粒之外的單顆粒PNP探針將能進一步地拓寬單顆粒光散射成像技術的應用范圍。另一方面，目前的單顆粒暗場成像技術雖能實時記錄多個PNP探針的動態行為，對樣品的多個區域進行同時監測，但尚不能夠對每次觀測獲得的海量數據進行全面快速的分析，主要還是依賴研究者的個人經驗選取個別有代表性的顆粒進行繁瑣的手動分析，從提取的有限信息中推斷出普遍性的結論。但是，隨著大數據分析技術的發展和普及，我們有望利用先進的數據挖掘技術，對每一單顆粒探針的時空軌跡進行詳盡的分析，并通過數據可視化技術，快速準確地從大量探針的各種時空變化過程之中提取出所需要的信息。因此，將單顆粒檢測技術與大數據分析相結合，必然能夠實現對復雜的生命過程更為細致的研究。總之，PNPs在生化分析和生物成像等領域仍舊有著巨大的發展潛力，而單個PNP光散射探針的應用也為單分子光譜技術注入了一股新鮮的活力。我們有理由相信，PNPs將會在未來更廣泛地應用于現實生活中快速、簡便的分析與成像之中。

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