Ⅰ型鴨甲型肝炎病毒3C基因在昆蟲細胞的表達與檢測

吳植+顧玲玲+朱善元+王安平

摘要：利用桿狀病毒表達系統進行Ⅰ型鴨甲型肝炎病毒蛋白水解酶3C基因的表達研究。首先通過PCR方法擴增出3C基因，亞克隆至桿狀病毒轉移載體pFastBac1中，獲得重組轉座載體pFB-3C，隨后將該重組質粒轉化感受態細胞DH10Bac進行同源重組，經藍白斑篩選及PCR鑒定后，獲得重組桿狀病毒穿梭質粒rBacmid-3C，將其在脂質體介導下轉染sf9昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒rBac-3C，并進行重組蛋白表達的檢測。間接免疫熒光結果，鴨抗全病毒陽性血清能夠與重組蛋白發生特異性結合。結果表明，DHAV-Ⅰ 3C蛋白在sf9昆蟲細胞中獲得了成功表達。

關鍵詞：Ⅰ型鴨甲型肝炎病毒；3C基因；昆蟲細胞；表達

中圖分類號： S858.32文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0033-02

鴨甲型肝炎病毒（duck hepatitis A virus，DHAV）主要侵害4周齡之內雛鴨，引起一種急性高度接觸致死性烈性傳染病，以角弓反張和肝臟病變為主要特征，1周齡以內的雛鴨病死率接近100%，嚴重危害我國養鴨業。DHAV可分為3種血清型，分別為DHAV-Ⅰ（經典的DHV-Ⅰ）[1]、DHAV-Ⅱ（新發現于臺灣的血清型）[2]、DHAV-Ⅲ（新發現于中國和韓國的血清型）[3-4]，3個血清型之間存在明顯的差異，無交叉免疫性。目前，我國DHAV-Ⅰ流行較普遍，對養鴨業危害最大。

DHAV-Ⅰ為小RNA病毒科的成員，具有小RNA病毒的基本結構，整個基因組分為3個部分：5′非編碼區（untranslated region，UTR），1個編碼多聚蛋白的開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）和3′非編碼區（3′UTR），3′UTR之后是poly（A）尾。ORF編碼的聚合蛋白分為1個結構蛋白區（P1）和2個非結構蛋白區（P2、P3），結構蛋白P1在病毒自身編碼的蛋白酶的作用下可以水解成VP0、VP1、VP3 3種衣殼蛋白；P2區可以裂解為2A1、2A2（2A3）、2B、2C 4種或5種非結構蛋白；P3區又可以裂解為3A、3B、3C、3D 4種非結構蛋白。其中3C蛋白是一種蛋白水解酶，在多聚蛋白的水解以及病毒的復制、形成過程中發揮重要作用[5-6]。本研究利用桿狀病毒/昆蟲細胞系統表達DHAV-Ⅰ 3C基因，為3C蛋白的開發應用奠定了基礎。

1材料與方法

1.1載體、菌株和毒株

DHAV-Ⅰ SH株由中國農業科學院上海獸醫研究所惠贈；感受態細胞DH10Bac、DH5α、桿狀病毒轉移載體pFastBac1、含有目的基因的重組質粒pET-3C均由江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室制備并保存。

1.2工具酶和試劑

轉染試劑Cellfectin Ⅱ Reagent購自Invitrogen公司；限制性內切酶、T4 DNA連接酶、pfu DNA聚合酶購自Fermentas公司；FITC標記的羊抗鴨IgG購自KPL公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（Amp）、卡那青霉素（Kan）、四環霉素（Tet）、慶大霉素（Gen）購自Sigma公司；昆蟲細胞培養基Sf-900 Ⅱ SFM（serum free medium）購自GBICO公司；其他試劑均為國產分析純級。

1.3引物的合成

根據GenBank中DHAV-1 SH株病毒全基因組序列（登錄號FJ157178），設計1對特異性引物以擴增其開放閱讀框，并在上下游引物5′端分別引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點，3C-F：5′-TATGGATCCATGAGCGGGCGGGTGAATTTCAGAC-3′（BamHⅠ酶切位點），3C-R：5′-CGCCTCGAGTTATTGG TTAAAAACTGGAAAAACC-3′（XhoⅠ酶切位點），通用引物M13序列參照桿狀病毒表達系統操作說明書設計。引物均由上海生工生物工程技術有限公司合成。

1.43C基因的擴增

以含有目的基因的重組質粒pET-3C為模板高保真PCR擴增3C基因。50 μL擴增體系：pfu DNA Polymerase 1 μL、10×Buffer 5 μL、Primer F 1 μL、Primer R 1 μL、dNTP（2 mmol/L）5 μL、DNA 1 μL、DDW 36 μL。反應程序為 94 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性 20 s，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸 90 s，30個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5重組轉座載體pFB-3C的構建

將回收的PCR產物及桿狀病毒載體pFastBac1分別用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后，回收3C基因片段及線性化的載體，T4連接酶連接，連接產物轉化感受態細胞E.coli DH5α。挑取單菌落，提取質粒，XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定。重組子命名為pFB-3C。

1.6質粒DNA的轉座

參照Invitrogen公司的桿狀病毒操作流程說明書，將重組質粒pFB-3C轉化感受態細胞DH10Bac，均勻涂布于含有IPTG、X-Gal的LB平板上（含慶大霉素、卡那霉素和四環素），37 ℃培養箱內培養，直至藍白斑出現。隨機挑取數個白色菌落，堿裂法提取質粒DNA，用引物M13進行PCR鑒定。PCR產物用0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7重組桿狀病毒rBac-3C的制備

將提取的重組桿粒rBacmid-3C和野生型Bacmid DNA參照轉染試劑說明書轉染昆蟲細胞sf9。轉染后約72 h，待細胞出現明顯病變、細胞變大時，收集細胞上清，即為P1代 rBac-3C，4 ℃避光保存備用。參照Invitrogen公司的桿狀病毒操作流程說明書，將P1代重組桿狀病毒在sf9昆蟲細胞上進行擴增，直至P3代，并利用空斑試驗測定P3代rBac-3C的病毒滴度。endprint

1.8表達產物的間接免疫熒光鑒定

將P3代rBac-3C按MOI為5感染24孔板中處于對數生長期的sf9細胞，72 h后，棄去上清，用預冷的冷丙酮固定20 min，PBS洗滌3次，用5% BSA室溫封閉1 h，加入鴨抗全病毒血清（1 ∶100），37 ℃孵育2 h后，PBST洗滌3次后，加入FITC標記的羊抗鴨IgG（1 ∶100），37 ℃孵育30 min，PBST洗滌3次后，在熒光倒置顯微鏡下觀察特異性熒光。

2結果與分析

2.1目的基因的克隆

高保真PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見1條大小約為580 bp的目的條帶（圖1），與預期值一致。

2.2重組轉座載體pFB-3C的構建與鑒定

3C基因經XhoⅠ和BamHⅠ酶切后插入經同樣酶切的pFastBac1，XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定，結果出現約580 bp和4 800 bp的2條條帶（圖2），與預期結果相符。

2.3重組Bacmid的篩選與鑒定

用M13引物對重組Bacmid進行PCR鑒定，結果rBacmid-3C的擴增條帶大小約為2 900 bp，與預期片段大小相符（圖3），說明3C基因轉座成功。

2.4表達產物的間接免疫熒光檢測

以鴨抗全病毒血清為一抗對昆蟲細胞內的表達產物進行間接免疫熒光檢測，從圖4可以看出，rBac-3C感染的昆蟲細胞胞漿內有大量特異性熒光出現，而野生型桿狀病毒感染的細胞內則未觀察到。

3討論

鴨甲型肝炎病毒屬于小RNA病毒科禽肝炎病毒屬。3C蛋白是小RNA病毒的自身蛋白水解酶之一，能夠正確水解多種前體蛋白，從而保證了衣殼的形成。3C蛋白酶不但能夠水解自身的前體多聚蛋白，還能水解宿主細胞內的蛋白，包括一些細胞的骨架蛋白、翻譯因子、固有免疫信號分子等，從而抑制宿主蛋白的功能發揮，保證了病毒蛋白有效逃避固有免疫的監控，在病毒顆粒的穿入和釋放中發揮重要的作用[7]。

Bac-to-Bac系統作為桿狀病毒表達系統己被廣泛使用，且己被商業化。Bac-to-Bac系統主要利用Luckow等研發的基因轉座技術而形成[8]。該系統優點是可以高效獲得重組桿狀病毒，效率可達100%，避免了以前采用同源重組機制獲得重組桿狀病毒效率較低的問題。與原核表達系統相比，該系統具有蛋白質翻譯后修飾所必需的酶系統，能對外源蛋白進行糖基化、磷酸化和信號肽切除等翻譯后加工修飾，從而保留表達蛋白的生物學活性[9]。

本研究利用桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統成功制備了表達3C蛋白的重組桿狀病毒，間接免疫熒光結果顯示，陽性鴨抗全病毒血清能與重組蛋白3C發生特異性結合，說明重組蛋白3C具有良好的反應原性，由于是首次利用該系統表達3C蛋白，后續將從優化密碼子角度出發提高重組蛋白的表達量，為3C功能的進一步研究奠定基礎。

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