梭魚脂肪酸合成酶基因部分片段的克隆和表達分析

楊文平+王愛民+於葉兵+劉飛+呂林蘭+呂富

摘要：分離、克隆梭魚脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，簡稱FAS）基因的部分cDNA片段（GenBank登錄號為KJ848474），共920 bp，編碼303個氨基酸，序列分析表明梭魚FAS基因與其他物種的同源性為74%～95%，其中與軍曹魚、斑馬擬麗魚相似性達95%。FAS基因mRNA在梭魚魚皮、肌肉、肝臟、心臟、脾臟、腎臟、胃、腸、腹腔脂肪、腦和鰓組織中表達豐度差異顯著（P<0.05），腦中含量最高，其次是肝臟和腹腔脂肪組織，肌肉中表達量最低，其余7種組織中的表達量均顯著低于腦和肝臟（P<0.05）。此外，還研究了飼料脂肪水平對梭魚FAS活性和mRNA表達的影響，平均質量為（9.5±0.3）g的梭魚幼魚投喂6種不同脂肪含量的等氮等能飼料（脂肪水平分別為2.04%、4.83%、747%、979%、12.01%、14.59%），飼養60 d，試驗結束后測定各組梭魚肝臟中FAS的生物活性及肝臟、腹腔脂肪、肌肉中FAS mRNA的表達豐度。結果表明，隨著飼料脂肪水平的升高，肝臟中FAS活性呈降低趨勢，14.59%組的活性顯著低于2.04%、4.85%組（P<0.05）；肝臟中FAS的mRNA表達量顯著下降（P<0.05）；肌肉和腹腔脂肪中FAS的mRNA表達量呈下降趨勢，但各組之間差異不顯著（P>0.05）。

關鍵詞：梭魚；脂肪水平；脂肪酸合成酶；克隆；基因表達分析活性；同源性；系統進化樹

中圖分類號： Q78；Q959.478文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0049-06

屬鯔形目鯔科梭屬魚類，是溫帶淺海區重要的經濟魚類之一，具有廣鹽性、廣溫性、適應性廣、病害少、味道鮮美等諸多優點，目前是江蘇沿海正在開發的海淡水養殖新興品種之一。在目前的養殖中，較易出現腹部肥大的癥狀：解剖后，可見腸道表面脂肪覆蓋明顯，肝臟肥大；此種體形與梭魚本該具有的長流線形身體不符，不受消費者歡迎；有關梭魚產生上述癥狀的原因，目前并無研究。魚類內臟尤其是肝臟脂肪過度聚積，產生脂肪肝或腹部肥大，這些是由于脂代謝紊亂造成脂肪在內臟內的沉積而出現的病理、生理學改變，它的發生、發展跟脂代謝關鍵因子有重要聯系，脂代謝關鍵因子在這一過程中到底如何作用？是否可以通過營養調控的角度減少或避免此類癥狀的產生？脂代謝相關的基因眾多，脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，簡稱FAS）是脂代謝過程中的關鍵酶之一。動物體內脂肪的沉積量是脂肪的合成和降解過程動態平衡的結果，其合成和分解過程都是通過一系列酶催化完成的。動物體脂沉積所需要的脂肪酸大多來自脂肪酸的全程合成，即由FAS催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成脂肪酸，FAS活性的高低對控制動物體脂沉積具有重要意義[1]。因此，本研究克隆了梭魚FAS基因的cDNA部分序列，并與其他物種進行同源性比較、系統發生進化樹分析組織特異性表達，為進一步研究梭魚的脂肪代謝機制奠定分子生物學基礎。此外，梭魚的營養需求研究基礎薄弱，配合飼料的生產主要借鑒其他雜食性魚類的營養需要，不合理的營養水平也可能是產生腹部肥大的原因。作為水產動物重要的營養素之一，脂肪是魚類重要的能源物質，不同的魚對脂肪的需求不同，飼料中不合理的脂肪水平會導致魚體腹部累積大量的脂肪[2-3]。因此，本研究針對飼料脂肪水平對FAS基因表達的影響進行初探，從營養和基因表達調控的角度了解梭魚的脂質代謝，為梭魚的健康養殖提供理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗設計

基因克隆和組織特異性表達用魚由江蘇省響水縣一個養殖場提供，魚體質量約300 g，運回后飼養于體積約 3 000 L 的水泥池（3 m×1 m×1 m）中，用普通商品飼料喂養，適應2周后即挑選10尾健康的梭魚，用MS-222麻醉，于無菌操作下解剖，取魚皮、肌肉、肝臟、心臟、脾臟、腎臟、胃、腸、腹腔脂肪、腦和鰓11種組織，用液氮速凍后于-80 ℃冰箱中保存備用。

脂肪水平試驗用魚由江蘇省射陽縣朱平水產苗種有限公司提供，運回后用5%食鹽水消毒，然后放入水泥池（3 m×1 m×1 m）中馴養10 d，挑選540尾健康無傷、規格均一的魚種[均質量（9.5±0.3）g]，隨機分為6組，飼養于循環流水養殖桶中（規格：直徑80 cm、高度70 cm、體積約300 L），每組設置3個重復，每個重復30尾魚，分別投喂6種不同的飼料。6種飼料配制如下：以魚油為脂肪源，添加水平分別為0、25%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%，進口魚粉、豆粕等為主要蛋白源，制成脂肪含量分別為2.04%、4.83%、7.47%、979%、12.01%、14.59%，蛋白質含量為30.32%的6組等氮等能飼料，配方見已發表文獻[4]。正式飼養期間，投飼率為魚體總質量的3%～5%，每天分3次投喂，投喂時間為 06：30、12：30、18：30，試驗期間除投喂外全天充氧，水溫控制在（24±2） ℃，養殖60 d。試驗結束后饑餓24 h，用MS-222對魚進行麻醉，每個重復取3尾魚，無菌操作下取肝臟、肌肉、腹腔脂肪用液氮速凍，然后放入-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2試劑及儀器

Trizol Reagent（Promega）、反轉錄酶M-MLV、RnaseH、TdT酶、Taq酶、連接酶、SYBR ExScriptTMRT-PCR Kit試劑盒均購自TaKaRa（大連）；Taq酶、膠回收試劑盒、pUCm-T載體購自上海申能博彩生物科技有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α由無錫淡水漁業中心農業部淡水魚類遺傳育種和養殖生物學重點開放實驗室保存；定量PCR采用進口Axygen PCR管。魚FAS酶聯免疫分析試劑盒購于上海江萊生物科技有限公司，其他常規化學藥品均為分析純。

熒光定量PCR儀（CFX96TM Real-Time PCR Detection Systerm，美國伯樂Bio-Rad公司）；普通PCR儀（T100TM Thermal Cycler，美國伯樂Bio-Rad公司）；冷凍型臺式大容量高速離心機（Centrifuge 5804R，德國艾本德Eppendorf公司）；核酸蛋白測定儀（Biophotometer plus，德國艾本德Eppendorf公司）；超低溫冰箱（Forma 900 series，美國熱電Thermo公司）；多功能酶標儀（Infinite M200，瑞士帝肯Tecan集團公司）。endprint

1.3方法

1.3.1肝臟組織FAS活性測定稱取適量的組織樣品，按 1 ∶9 的質量體積比加入0.65%生理鹽水制成10%勻漿液，3 000 r/min 離心15 min，取上清液進行測定，具體方法按照試劑盒說明書進行。

1.3.2引物設計與合成通過同源比對設計兼并引物，FAS-F和FAS-R擴增FAS中間片段。根據已經分離出的梭魚FAS cDNA部分片段（GenBank登錄號為KJ848474），使用Codehop原理設計FAS熒光定量引物F1和R1，根據梭魚 β-actin的部分序列（GenBank登錄號為EF638008.1）設計梭魚β-actin熒光定量引物F2和R2，引物序列見表1，所有引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，擴增的片段為80～120 bp。

（2）cDNA第1條鏈的合成。按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄反應，反應條件為：42 ℃ 40 min，90 ℃ 2 min；4 ℃下保溫至關機，所得的模板（cDNA溶液）于-20 ℃保存備用。

（3）FAS基因中間片段的獲得。使用兼并引物FAS-F/FAS-R擴增FAS中間片段，PCR反應體系見表2，反應條件為：94 ℃ 預變性3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環；最后72 ℃ 10 min，-20 ℃保存產物。

2結果與分析

2.1梭魚FAS基因的克隆與序列分析

使用梭魚肝臟cDNA為模板，擴增梭魚FAS cDNA部分片段，部分序列和氨基酸翻譯結果見圖1，序列長度為 920 bp，編碼303個氨基酸，該序列已經登錄GenBank，登錄號為KJ848474。

為確定FAS的進化關系，從基因庫中收集了軍曹魚（Rachycentron canadum，ACZ55138.1）、斑馬擬麗魚（Maylandia zebra，XP 004571519.1）、尼羅非魚（Oreochromis niloticus，XP 003454104.1）、鳉魚（Oryzias latipes，XP 004080750.1）、銀鯽（Carassius gibelio，AHA42647.1）、團頭魴（Megalobrama amblycephala，AHK05976.1）、雞（Gallus gallus，NP99048.6）、老鼠（Rattus norvegicus，AAA41145.1）、人（Homo sapiens，AAH63242.1）、恒河猴（Macaca mulatta，XP 001113076.1）等FAS氨基酸序列。用ClustalW 1.8把梭魚FAS氨基酸序列同它們進行同源性比較，同時使用上述比對結果，采用Neighbor-Joining方法構建系統發育樹（圖2），上標數據為1 000次自展值Bootstrap檢測的支持率。序列分析顯示，梭魚FAS基因與其他物種的同源性為74%～95%，與硬骨魚類的FAS序列相似性最高，其中與軍曹魚、斑馬擬麗魚相似性達到95%。此外，梭魚FAS基因與其他物種的FAS基因同源性也較高，與雞、老鼠的同源性為80%、77%，與人、恒河猴的同源性為74%。以上結果顯示，在氨基酸水平上，本試驗所克隆到的 FAS 基因與其他物種具有高度的相似性，

判定是梭魚的FAS基因，且FAS基因在進化過程中較為保守。

系統發育樹表明，親緣關系近的物種先聚在一起，如梭魚、軍曹魚以及斑馬魚等硬骨魚類形成聚類，然后才和親緣性較遠的人、雞、老鼠、恒河猴形成聚類。說明親緣性近的物種的FAS基因的同源性也高。

2.2梭魚FAS基因mRNA組織特異性表達

梭魚11種組織中FAS mRNA的表達豐度見圖3。FAS mRNA在11種組織中均有表達，不同組織中的表達量部分之間差異顯著（P<0.05），從高到低依次為腦、肝臟、腹腔腸系膜脂肪、腎、鰓、皮膚、胃、脾、心、腸、肌肉。在肌肉中表達量最低，高表達在腦、肝臟和腹腔腸系膜脂肪組織中，分別為肌肉中表達量的270.08、145.51、101.30倍，其余各組織中表達量均顯著低于這3種組織（P<0.05）。FAS mRNA在腎、鰓、皮膚、胃和脾臟5種組織中有中等程度的表達，前4種組織中的表達量均顯著高于脾臟（P<0.05）；在心臟和腸中表達量較低，但顯著高于肌肉（P<0.05）。

2.3飼料脂肪水平對梭魚肝臟中FAS活性的影響

飼料脂肪水平對梭魚肝臟中FAS活性的影響見圖4。隨脂肪水平的升高，肝臟中FAS活性呈下降趨勢，脂肪水平為204%、4.83%、7.47%、9.79%、12.01%組之間差異不顯著（P>0.05），14.59%組顯著低于2.04%、4.83%組（P<0.05）。

2.4飼料脂肪水平對梭魚FAS mRNA表達水平的影響

梭魚肝臟、腹腔脂肪、肌肉組織中FAS mRNA的相對表達量見圖5至圖7。隨著飼料脂肪水平的升高，肝臟中FAS mRNA的表達豐度逐漸下降， 4.83%、 7.47%、9.79%這3組

之間差異不顯著，12.01%、14.59%這2組之間差異不顯著，但均顯著低于2.04%、4.83%組。腹腔脂肪和肌肉中FAS mRNA的表達豐度隨脂肪水平的升高呈下降趨勢，但各組之間差異均不顯著（P>0.05）。

3結論與討論

FAS是脂肪合成過程中的一個關鍵酶，催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成脂肪酸，對于控制動物體脂的沉積具有重要意義，開展FAS基因的克隆及表達分析，有助于從分子學的角度探索脂肪代謝和合成的規律。魚類中有關FAS基因的研究相對較少，主要有軍曹魚、斑馬擬麗魚、羅非魚、團頭魴等，因此魚類FAS基因的結構、功能和表達信息還有待于進行大量的研究。本研究從梭魚中克隆了FAS cDNA的部分序列（GenBank登錄號為KJ848474），長度為920 bp，編碼303個氨基酸。通過系統進化樹分析可知，FAS基因具有較高的保守性，梭魚和其他物種相似性較高，其中和魚類的相似性最高。endprint

有關FAS mRNA的組織特異性表達，已有研究者在不同的生物體內作了研究，但研究結果各不相同。在番鴨的研究中發現，FAS mRNA在肝臟和腹脂中表達量最高，在脾臟、肺臟和下丘腦中表達量次之，在心臟、腎臟、肌胃、腺胃、胸肌、腿肌、十二指腸中表達量很少或幾乎不表達[6]。但在豬體內，FAS mRNA高表達在脂肪組織、肝臟、小腦和胃中[7]。匙吻鱘肝臟中FAS mRNA的表達量最高，其次是腹腔脂肪，肌肉、腸道、心臟、鰓、鰭條、眼睛、胃和吻這8種組織中只有少量的表達[8]。而鳙魚咽上組織中FAS mRNA表達量最高，其次是腸道組織，在肝臟、肌肉、心臟、鰓、鰭和眼中的表達水平顯著低于咽上器官[8]。覃川杰在瓦氏黃顙魚的研究中指出，FAS mRNA主要在腸道、肝臟、腹腔脂肪、肌肉和腦組織中表達，腸道中最高，肝臟中次之，顯著高于后幾種組織[9]。本研究發現，FAS mRNA在梭魚腦、肝臟和腹腔腸系膜脂肪組織中有高表達，在腎臟、鰓、皮膚、胃、脾臟中有中等程度的表達，心臟、腸和肌肉組織中表達量較低。以上結果表明，FAS mRNA的組織特異性表達在不同物種中既有一定的相似性（高表達一般在肝臟、腹腔脂肪組織），又有一定的差異性。不同物種不同組織合成脂肪的能力有所不同，豬主要在脂肪組織中合成脂肪，禽類和魚類主要通過肝臟合成脂肪[10-12]。基于不同時空條件和不同的發育階段，同一組織細胞所處的狀態各不相同。Kusakabe等指出，FAS較高表達出現在脂質代謝旺盛的細胞（如脂肪細胞、肝細胞、皮脂腺等）、處于增殖狀態的細胞（如胎兒消化呼吸系統增殖上皮、胃、十二指腸上皮細胞）以及對激素敏感的細胞（如垂體前葉、乳腺、前列腺、子宮內膜等）中[13]。這些可能是以上不同物種FAS mRNA組織表達差異性的原因。Semenkovich指出，機體組織中FAS mRNA表達水平的升高會增加甘油三酯在組織內的沉積而導致肥胖[14]。夏曉杰等的研究也表明，齊口裂腹魚肌間脂肪含量與FAS mRNA表達水平呈一定的正相關關系[15]。而FAS mRNA在不同組織中的差異性表達是否會導致不同組織中脂肪的蓄積程度不同？目前該方面的研究已在肝臟和肌肉中有少量結果，即肝臟是魚類合成脂肪的主要場所及脂肪蓄積的調節性儲脂器官[16-17]。在瓦氏黃顙魚[9]、吉富羅非魚[18]、齊口裂腹魚[15]中的研究均表明，肝臟中FAS基因的表達水平顯著高于肌肉中，這可能是導致魚類肝臟和肌肉脂肪蓄積差異的主要原因。研究魚類脂代謝相關基因的組織差異性表達，可以從分子生物學的角度調控魚體脂肪的沉積，為提高魚體健康和魚肉品質提供理論依據。

動物體內FAS活性的高低，受日糧營養素的影響，其中日糧中脂肪含量的高低及脂肪酸種類對FAS的活性起著重要的決定作用。有研究表明，飼料中脂肪水平的升高，會抑制魚類FAS的活性[19-20]。本研究發現，隨著脂肪水平的升高，肝臟中FAS活性逐漸降低，進一步證實了高脂對FAS活性的抑制作用，中華絨螯蟹和白甲魚的研究也得到了相同的結論[21-22]。Weiss等指出，當飼料提供的外源性脂肪酸充足時，不需要合成內源性脂肪酸，因此FAS活性下降[23]。而Clarke等研究發現，日糧中脂肪對FAS活性起抑制作用，主要是脂肪酸抑制FAS基因的表達，這種抑制發生在轉錄水平，導致脂肪的合成減少，這種抑制能力和脂肪酸的數量、種類有關[24-25]。本研究中所采用的魚油含有大量n-6和n-3系列不飽和脂肪酸，是FAS表達的強抑制劑，因此高脂水平時FAS活性顯著下降。

FAS基因的表達受激素、攝食營養成分等的影響[14]。大鼠在飼喂高碳水化合物飼糧時，肝臟中FAS mRNA的表達量約為絕食時的100倍；喂高脂（玉米油和牛脂1 ∶1混合）日糧時FAS mRNA的表達量比絕食時有所增加，但只有喂高碳水化合物時表達水平的4%[26]。大量研究表明，日糧中的脂肪酸對FAS基因的表達有抑制作用。抑制作用的強弱和脂肪酸的數量、碳鏈長度、雙鍵位置、雙鍵數量有關。第1個雙鍵的位置為n-9時（位于碳鏈甲基端第9、第10個碳原子之間），對FAS表達的抑制作用和飽和脂肪酸類似，基本無影響；第1個雙鍵位于n-3時（在碳鏈甲基端第3、第4個碳原子之間），抑制作用比位于n-6強（在碳鏈甲基端第6、第7個碳原子之間）[24，27-28]。Ikeda等指出，二十二碳六烯酸（docosahexa enoic acid，簡稱DHA）、二十五碳五烯酸（eicosapenta enoic acid，簡稱EPA）和亞麻酸相比，顯著降低了肝臟中FAS活性及肝臟和血漿中甘油三酯的濃度，DHA和EPA相比，DHA更有效，這說明同一系列的脂肪酸，雙鍵數量多的對FAS表達的抑制作用更強[29]。本研究發現，脂肪水平的升高，顯著降低了梭魚FAS mRNA的表達量，脂肪水平483%、7.47%、9.79%組表達量顯著低于2.04%、4.83%組，12.01% 、14.59%組表達量顯著低于其余各組，這可能是由于高脂肪水平的攝入，準確來講是大量的n-3和n-6系列多個飽和脂肪酸（polyunsa thrated fatty acid，簡稱PUFA）的攝入，使FAS基因的表達受到了抑制。這和馬晶晶報道的飼料中含有較高含量的n-3高度不飽和脂肪酸（highly unsaturated fatty acid，簡稱HUFA，大于0.88%）時，黑鯛幼魚FAS基因表達量顯著下降的結論[30]是一致的。Clarke等在大鼠的研究中也指出，含有豐富PUFA的魚油和紅花油可以使肝臟中FAS mRNA的表達量降低75%～90%[26]。本研究中隨著脂肪水平的升高，腹腔脂肪和肌肉組織中FAS mRNA的表達量僅表現出下降趨勢，各組之間差異并不顯著；這可能和不同組織基因表達的特異性有關，Clarke指出，脂肪酸對FAS基因表達的抑制具有組織專一性，肝臟中FAS基因的轉錄量決定了FAS mRNA的水平，但脂肪組織中FAS mRNA 的水平除了取決于基因的轉錄量外，還和影響FAS mRNA穩定性的因素有關[23]。目前，這方面的研究較少，尚需更深入的研究。endprint

本研究克隆了梭魚的FAS基因部分cDNA序列，通過系統進化樹可知，FAS基因具有較高的保守性，梭魚和其他物種相似性較高；FAS基因在梭魚不同組織中的表達豐度差異顯著，在腦、肝臟和腹腔脂肪組織中高表達，在肌肉中表達量最低；飼料脂肪水平能夠抑制梭魚肝臟中的FAS活性和 mRNA的表達豐度，水平高時抑制作用更顯著。

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