馬尾藻多糖對PCV—2體外感染3D4/2細胞活性及炎癥相關因子的影響

譚紅連+楊劍+尹丹+郝祝兵+韋英益+胡庭俊

摘要：首先通過MTT法檢測馬尾藻多糖對3D4/2細胞活性的影響，然后用ELISA法檢測炎癥相關因子。試驗結果，PCV-2感染3D4/2細胞后明顯降低細胞活性，馬尾藻多糖25、50、100、200、400 μg/mL處理后，均能提高感染細胞的活性；PCV-2感染3D4/2細胞后均能顯著提高TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等炎癥因子的水平，馬尾藻多糖處理后，25、50、100、200、400 μg/mL均能在一定程度上降低TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、MCP-1的分泌水平，且其中25、50 μg/mL的效果最明顯。結果表明，馬尾藻多糖具有較好的體外抗炎作用，且其抗炎作用機制可能與其抑制炎癥因子IL-1β、IL-8、IL-10、TNF-α、MCP-1等的分泌有關。

關鍵詞：馬尾藻多糖；PCV-2；3D4/2細胞；炎癥因子

中圖分類號： S853.74文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0166-03

收稿日期：2016-06-29

豬圓環病毒Ⅱ型（porcine circovirus type Ⅱ，PCV-Ⅱ）是斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（postweaning mutisystenic wasting syndrome，PMWS）的主要致病原，已成為影響全球養豬業的重大疾病，導致巨大的經濟損失。PCV-Ⅱ病毒復制的主要場所是機體的單核-巨噬細胞和抗原遞呈細胞，PCV-Ⅱ感染后，病豬體內肺、肝、腎、扁桃體、胸腺、外周血單核細胞、支氣管淋巴結、腹股溝淋巴結中均能檢測到PCV-Ⅱ病毒核酸[4]，PCV-Ⅱ感染主要表現為淋巴細胞缺失和單核細胞浸潤等。本試驗就馬尾藻多糖對感染PCV-Ⅱ的3D4/2細胞增殖活性及炎癥相關細胞因子分泌的影響進行觀察，探討馬尾藻多糖抗炎作用分子機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒和細胞豬圓環病毒Ⅱ型（SH株）（PCVⅡ）為南京農業大學農業部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室分離保存，經PK-15細胞增殖后測得病毒滴度為104 TCID50/0.1 mL。豬肺泡巨噬細胞系3D4/2細胞由廣西大學動物科學技術學院預防獸醫學教研室提供。

1.1.2試驗藥物馬尾藻多糖，廣西大學動物科學技術學院藥理實驗室提供。

1.1.3主要儀器和試劑Multimode Plate Reader多功能酶標儀（TECAN）；RPMI 1640培養液（Gibc）；胎牛血清（Gibco）；噻唑藍MTT（索萊寶）；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、白介素-10（IL-10）、巨噬細胞趨化蛋白-1（MCP-1）ELISA檢測試劑盒（欣博盛）。

1.2試驗方法

1.2.1馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細胞活性的影響分別設置細胞對照組、病毒對照組和6個不同藥物濃度組（25、50、100、200、400、800 μg/mL），當細胞密度至1×106 cell/mL時，接至96孔板，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2條件下過夜使其貼壁。細胞對照組加入無血清1640培養液 200 μL，病毒組及藥物組加入等量10-1PCV-2病毒液，37 ℃，5% CO2培養箱中吸附2 h，棄去病毒液，PBS緩沖液清洗3次后，細胞對照組、病毒對照組每孔加入100 μL含5% FBS-1640培養液，藥物組加入等量不同濃度SP繼續培養 8 h，用于檢測細胞活性。

1.2.2馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細胞炎癥相關因子的影響分別設置細胞對照組、病毒對照組和5個不同藥物濃度組（25、50、100、200、400 μg/mL），調節細胞濃度為1×106 cell/mL鋪于24孔板中，1 000 μL/孔，37 ℃、5% CO2培養使細胞貼壁。棄上清，細胞對照組加入1 000 μL/孔培養液，病毒組、藥物組加入10-1 PCV-2病毒液1 000 μL/孔，37 ℃、5% CO2培養2 h，棄上清，細胞對照組、LPS組、病毒對照組加入1 000 μL/孔培養液，藥物組分別加入不同濃度馬尾藻多糖，37 ℃、5% CO2培養12 h，收集細胞上清液，用于 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等炎癥相關因子的檢測。

1.2.3MTT法檢測細胞活性按上述處理細胞培養3D4/2細胞8 h后，每孔吸棄10 μL上清，各組細胞每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL），繼續培養4 h。培養結束后，棄掉孔內液體，每孔加入100 μL DMSO，搖勻，靜置10 min，置酶標儀上測定D570 nm值。

1.2.4ELISA法測定炎癥相關因子分泌水平按照上述處理后收集細胞上清，根據ELISA法檢測炎癥因子（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、MCP-1）分泌水平，嚴格按照炎癥因子（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、MCP-1）測定試劑盒說明進行操作。

1.3數據分析

試驗數據采用SSPS 18.0統計軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）。

2結果與分析

2.1不同濃度馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細胞12 h存活率的影響

由圖1可見，PCV-2感染3D4/2細胞明顯降低細胞活性，與細胞對照組相比差異極顯著（P<0.01）；加入馬尾藻多糖處理后，50、100、200、400 μg/mL馬尾藻多糖能提高感染3D4/2細胞活性，與病毒對照組相比差異極顯著（P<0.01）。表明馬尾藻多糖能顯著提高PCV-2感染3D4/2細胞活性。endprint

2.2不同濃度馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細胞TNF-α分泌的影響

由圖2可見，PCV-2感染3D4/2細胞后升高細胞TNF-α水平，與空白對照組相比差異極顯著（P<0.01）；加入馬尾藻多糖處理后，與病毒對照組相比，25、50、100 μg/mL馬尾藻多糖能極顯著降低TNF-α水平（P<0.01）；200 μg/mL馬尾藻多糖能顯著降低TNF-α水平（P<0.05）；400 μg/mL馬尾藻多糖能降低TNF-α水平，但差異不顯著（P>0.05）。

2.3不同濃度馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細胞IL-1β分泌的影響

由圖3可見，PCV-2感染3D4/2細胞后升高細胞IL-1β水平，與空白對照組相比差異極顯著（P<0.01）；加入馬尾藻多糖處理后，與病毒對照組相比，25、50 μg/mL馬尾藻多糖能極顯著降低IL-1β水平（P<0.01），100、400 μg/mL馬尾藻多糖能降低IL-1β水平，但差異不顯著（P>0.05）。

2.4不同濃度SP對PCV-2體外感染3D4/2細胞IL-6分泌的影響

由圖4可見，PCV-2感染3D4/2細胞后升高細胞IL-6水平，與空白對照組相比差異顯著（P<0.05）；加入馬尾藻多糖處理后，與病毒對照組相比，25 μg/mL馬尾藻多糖降低 IL-6水平，但差異不顯著（P>0.05）；50、100、200、400 μg/mL 馬尾藻多糖均能顯著或極顯著升高IL-6水平（P<0.05，P<0.01）。

2.5不同濃度馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細胞IL-8分泌的影響

由圖5可見，PCV-2感染3D4/2細胞后升高細胞IL-8水平，與空白對照組相比差異極顯著（P<0.01）；加入馬尾藻多糖處理后，與病毒對照組相比，25、50、100 μg/mL馬尾藻多糖能極顯著降低IL-8水平（P<0.01）；200 μg/mL SP能顯著降低IL-8水平（P<0.05）；400 μg/mL馬尾藻多糖能降低IL-8水平，但差異不顯著（P>0.05）。

2.6不同濃度馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細胞IL-10分泌的影響

由圖6可見，PCV-2感染3D4/2細胞后升高細胞IL-10水平，與空白對照組相比差異極顯著（P<0.01）；加入馬尾藻多糖處理后，與病毒對照組相比，25、50 μg/mL馬尾藻多糖能極顯著或顯著降低IL-10水平（P<0.01，P<0.05），100、200、400 μg/mL馬尾藻多糖能降低IL-10水平，但差異不顯著（P>0.05）。

2.7不同濃度馬尾藻多糖對PCV-2體外感染3D4/2細胞MCP-1分泌的影響

由圖7可見，PCV-2感染3D4/2細胞后升高細胞 MCP-1水平，與空白對照組相比差異不顯著（P>0.05）；加入馬尾藻多糖處理后，與病毒對照組相比，25、50、100、200 μg/mL 馬尾藻多糖能降低MCP-1水平但差異不顯著（P>0.05）。

3討論

多糖、皂苷類和黃酮等是中藥的有效成分，具有促進細胞生長、參與免疫調節等功效。炎癥是機體受到各種致炎因素的刺激和損傷后，為滅活及移除這些致炎因素并為組織修復創造環境而產生的防御性反應，是一種十分常見而又重要的基本病理過程，是許多疾病的癥狀或并發癥，可引起局部或全身性反應。炎癥主要由細菌和病毒引起，也可因物理、化學、外傷等刺激而產生[5-7]。在炎癥反應中，巨噬細胞起著重要作用，是體內啟動炎癥介質產生的中心細胞，活化的巨噬細胞是參與炎癥反應的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等細胞因子的重要來源[8-9]，為調控炎癥反應的主要細胞，由炎癥反應所致免疫防御和免疫功能紊亂過程中，巨噬細胞是一個關鍵的參與者。

在本試驗中，PCV-2感染3D4/2細胞后顯著促進了TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、MCP-1等炎癥因子的分泌，而用馬尾藻多糖處理后，25、50、100、200、400 μg/mL馬尾藻多糖均在一定程度上抑制了TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、MCP-1等炎癥因子的分泌，其中20、50 μg/mL效果較明顯。

4結論

馬尾藻多糖能顯著提高PCV-2感染的3D4/2細胞活性，具有較好的體外抗炎作用，且其抗炎作用機制可能與其抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-10、MCP-1等的分泌有關。

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