樹莓葉果中水楊酸含量測定及其抑菌性分析

楊國慧+范婷婷+陳效杰+史影肖+呂孟杰+王昱文+趙珺祺+韓德果

摘要：為了解樹莓葉、果中水楊酸含量變化及其抑菌性能，采用高效液相色譜法測定6個不同樹莓品種不同生長時期和不同成熟度果實中的水楊酸含量，并以現(xiàn)保存菌種番茄灰霉病菌和大腸桿菌為材料分析其真菌、細(xì)菌抑菌性。結(jié)果表明，夏果型品種結(jié)果枝葉片水楊酸含量最高期出現(xiàn)在5月末，秋果型品種則出現(xiàn)在6月末，最高含量分別為2032、2.157 mg/g；樹莓果實成熟期水楊酸含量最高為1.390 mg/g；樹莓葉片和果實中水楊酸對番茄灰霉病菌和大腸桿菌的抑菌率最高分別為35.83%、81.72%。樹莓葉、果中水楊酸含量葉片高于果實，對大腸桿菌抑制效果強(qiáng)于番茄灰霉病菌的抑菌效果。

關(guān)鍵詞：樹莓；水楊酸含量；果實；葉片；抑菌性；高效液相色譜法

水楊酸（salicylic acid，簡稱SA）是植物體內(nèi)產(chǎn)生的簡單酚類化合物，作為精細(xì)有機(jī)合成中間體，可以用于香料、化妝品、防腐劑、配制動物性香精等[5-8]；同時水楊酸具有消炎、抗風(fēng)濕、解熱止痛的功效，對青霉、灰霉、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等多種菌類具有抑制作用，為化工醫(yī)藥工業(yè)的重要原料[9-10]。現(xiàn)有資料報道，樹莓葉片和果實中均含有豐富的水楊酸，含量可達(dá)1.434 mg/g[11-13]。但樹莓不同品種之間、同一品種不同生長時期葉片和不同成熟度果實中水楊酸含量存在多大差異，樹莓葉片和果實中水楊酸抑菌性如何，尚未有報道。

高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡稱HPLC）目前被廣泛用于檢測食品和藥品中的水楊酸含量。本研究以樹莓的不同品種為材料，利用高效液相色譜法，測定其不同發(fā)育時期葉片、不同成熟期果實中水楊酸的含量，并利用實驗室現(xiàn)保存菌種番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）和大腸桿菌（Escherichia coli）分析其抑菌效果，探討樹莓葉、果中水楊酸的生理活性性能，為今后樹莓葉、果的工業(yè)化利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

試驗以黑龍江地區(qū)廣泛種植的三年生樹莓栽培品種為材料，采用夏果型品種：美22（American Twenty-two）、DNS22、費爾杜德（Fertod Zamatos）；秋果型品種：秋福（Autumn Bliss）、金秋（Fall Gold）、哈瑞太茲（Heritage）。于2013年5、6、7、8、9月末分別采集上述品種結(jié)果枝成熟葉片以及不同成熟期（綠果期、轉(zhuǎn)白期、成熟期、過熟期）的果實，澆上液氮，-80 ℃保存?zhèn)溆肹14]。

1.2方法

1.2.1水楊酸的提取水楊酸提取參照張衛(wèi)等的方法[15]。具體過程如下：取葉1.0 g或果2.0 g，研磨勻漿，20 mL 90%甲醇，10 000 r/min離心30 min，重復(fù)2次，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸干，15 mL 5%三氯乙酸加40 mL體積比1 ∶1乙酸乙酯 ∶環(huán)己烷混合液萃取2次，合并下層水相，15 mL 8 mol/L HCl密封，80 ℃ 恒溫水浴60 min，40 mL體積比1 ∶1乙酸乙酯 ∶環(huán)己烷混合液萃取2次，合并上層有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸干，30 mL 80%色譜級甲酸溶解，20%（0.2 mol/L，pH值為5.5）乙酸鈉定容，0.45 μm微孔過濾，濾液置于冰箱冷藏層保存。

1.2.2水楊酸含量的測定Waters2695色譜儀，色譜柱型號依利特SinoChrom C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）柱，流動相甲醇、乙酸鈉（0.2 mol/L pH值為5.5）體積比6 ∶4混合液，進(jìn)樣 10 μL，流速0.5 mL/min，紫外吸收波長296 nm，水楊酸標(biāo)樣來自壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，甲醇（色譜級）來自生工生物工程（上海）股份有限公司。

水楊酸的計算公式：

葉片y=30x/1 000；果實y=30x/2 000。

式中：x表示水楊酸濃度，μg/mL；y表示水楊酸含量，mg/g。

1.2.3水楊酸抑菌性分析使用實驗室現(xiàn)保存菌種，真菌為番茄灰霉病菌，細(xì)菌為大腸桿菌。真菌抑菌性分析采用十字交叉法，PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，將6 mm菌餅接入60%水楊酸提取液抑菌平板的中央，26 ℃恒溫培養(yǎng)，5 d后調(diào)查菌落直徑；細(xì)菌抑菌性分析采用菌落計數(shù)法，將供試菌種接種到LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床中于30 ℃培養(yǎng)48 h，稀釋107后吸取 200 μL 涂抹到制成的抑菌平板上，48 h后進(jìn)行菌落記數(shù)。上述試驗均以加入60%甲醇的平板為對照，每個處理3次重復(fù)。

真菌抑菌率SA=[（A0-6）-（A1-6）/（A0-6）]×100%；細(xì)菌抑菌率SA=[（A0-A1）/A0]×100%。

式中：A0為空白對照（60%甲醇流動相）真菌菌落直徑（mm）或細(xì)菌菌落數(shù)；A1為加入水楊酸提取液的真菌菌落直徑（mm）或細(xì)菌菌落數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用SPSS與Excel分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果與分析

2.1樹莓結(jié)果枝葉片不同時期水楊酸含量變化

美22、DNS22、費爾杜德屬夏果型品種，結(jié)果后結(jié)果枝葉片易干枯脫落，因此美22、DNS22在9月末未采集到葉片，而費爾杜德8月末就沒有采集到葉片。由圖1可見，夏果型樹莓3個品種美22、DNS22、費爾杜德5月葉片水楊酸含量最高，3個品種含量高低表現(xiàn)為費爾杜德

2.2不同成熟期樹莓果實中水楊酸含量的變化

圖2表明，樹莓果實中水楊酸含量和其成熟度有關(guān)：6個樹莓品種均隨著果實逐漸成熟，水楊酸含量逐步升高，成熟期達(dá)到最高值，而隨著過熟，含量又表現(xiàn)為降低。其中，哈瑞太茲成熟期水楊酸含量最高，為1.390 mg/g。6個樹莓品種果實的水楊酸含量變化趨勢一致，并沒有因為種類不同出現(xiàn)差異，出現(xiàn)高峰時期相同，均為成熟期。

2.3樹莓葉片和果實水楊酸含量比較

以6個樹莓品種葉片和果實中的水楊酸含量最高時期進(jìn)行比較，圖3表明，6個樹莓品種葉片中水楊酸含量均高于果實中的水楊酸含量，因此葉片中水楊酸含量并未因為品種不同而不同。

2.4樹莓水楊酸提取液的抑菌能力

6個樹莓品種不同月份葉片和不同發(fā)育時期果實水楊酸提取液對番茄灰霉病菌和大腸桿菌均有一定的抑制作用，其中DNS22在5月末的葉片和哈瑞太茲在綠果期的果實中水楊酸提取液對番茄灰霉病抑菌率最高，抑菌率分別為 25.89%、35.83%（圖4、圖5）；金秋在8月末的葉片和轉(zhuǎn)白期的果實中水楊酸提取液對大腸桿菌抑菌率最高，抑菌率分別為81.72%、78.38%（圖6、圖7）。但不同品種、不同生長發(fā)育時期的果實和葉片水楊酸提取液對番茄灰霉病菌和大腸桿菌的抑制能力沒有和其水楊酸含量表現(xiàn)出一致的相關(guān)關(guān)系。

3結(jié)論與討論

試驗中采用HPLC法測定樹莓葉片水楊酸含量在0.350～2.157 mg/g之間，果實中水楊酸含量為0.142～1.390 mg/g，且葉片中水楊酸含量高于果實中。年四輝等測得不同廠家板藍(lán)根藥材中的水楊酸含量，最高為 0.131 4 mg/g[16]；黃智鴻等測得不同時期榆錢中總水楊酸的含量最高為0.176 mg/g[17]；劉紹歡等測得不同地區(qū)透骨香中水楊酸最高含量為 0.205 mg/g[18]。和其他植物種類相比， 樹莓中的水楊酸含量

較高，尤其是樹莓葉片。

本研究結(jié)果中不同類型樹莓品種結(jié)果枝葉片中水楊酸含量高峰值出現(xiàn)時間不同：夏果型水楊酸5月含量最高，而秋果型品種水楊酸含量6月達(dá)到最大，這可能和不同類型品種的生長特性以及生產(chǎn)中采用的栽培措施有關(guān)。夏果型品種結(jié)果枝為二年生枝條，其上葉片萌發(fā)早，所以葉片水楊酸含量高峰期出現(xiàn)也早一些。果實成熟采摘后，結(jié)果枝上的葉片逐漸衰老、水楊酸含量顯著降低；秋果型品種一年生枝條為主要結(jié)果枝，春季萌芽前進(jìn)行平茬，葉片萌發(fā)較晚，水楊酸含量的高峰值出現(xiàn)時間也晚一些。嚴(yán)涵薇等采用HPLC法測定了5種玉米自交系玉米種水楊酸含量，顯示自交系間水楊酸含量大致相同，在1.36～1.51 μg/g之間[19]。可能玉米中水楊酸僅作為一種調(diào)節(jié)因子，微量即可調(diào)節(jié)植物生長。試驗中同時測定了3種顏色不同果實（紅樹莓：費爾杜德、秋福、哈瑞太茲；黃樹莓：DNS22、金秋；紫樹莓美22），發(fā)現(xiàn)水楊酸含量和果實色澤關(guān)系不大，主要和果實成熟度有關(guān)，成熟期果實含量最高。

水楊酸對真菌、細(xì)菌等具有一定的抑制作用。申曉慧等研究了水楊酸細(xì)菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和大腸桿菌的抑制作用，對3種菌抑制效果均表現(xiàn)明顯，且抑菌效果隨水楊酸濃度的增加而增強(qiáng)[20]。鄭國興等測得水楊酸對白色假絲酵母（Canidia albicans）、黑曲霉（Aspergillus nige）的抑菌率可分別達(dá)到75%、60%[21]。本研究結(jié)果顯示，樹莓葉片、果實提取液對真菌、細(xì)菌均有一定的抗性，最高分別達(dá)到35.83%、81.72%，對大腸桿菌抑制效果強(qiáng)于對番茄灰霉病菌的抑菌性。水楊酸HPLC法測定分析與抑菌性試驗表明，樹莓水楊酸含量豐富，且葉片含量高于果實，6個樹莓品種中，哈瑞太茲綠果期果實和金秋8月末葉片提取水楊酸抑菌性較高，可以作為醫(yī)藥工業(yè)的理想原材料。

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