野生蕨菜中總黃酮的提取及其抗氧化活性

曹葉霞+尹愛萍+王曼

摘要：以野生蕨菜為原料，采用超聲波輔助提取法，研究不同提取條件對野生蕨菜中總黃酮含量的影響及其清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的能力。首先在單因素試驗基礎上考察各因素對野生蕨菜總黃酮提取率的影響，然后采用正交試驗優化野生蕨菜總黃酮的提取工藝條件，同時比較其與維生素C在清除DPPH自由基方面的差異。結果表明，超聲輔助提取野生蕨菜中總黃酮的最優條件：超聲功率240 W，料液比1 g ∶35 mL，超聲時間 70 min，超聲溫度60 ℃。其中的顯著影響因素是超聲功率、超聲溫度，在最優條件下超聲波輔助提取野生蕨菜中總黃酮的提取率可以達到 3.34%。另外，野生蕨菜黃酮類化合物對DPPH自由基的清除率比相同濃度的維生素C溶液清除率高，其IC50值為 0.005 mg/mL，說明野生蕨菜總黃酮具有很好的抗氧化活性，從而為其綜合開發提供了一定的理論依據。

關鍵詞：野生蕨菜；超聲提取；總黃酮；正交試驗；DPPH

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0194-04

目前有多種黃酮提取方法，但在眾多方法中，有機溶劑提取法存在溶劑成本高、毒性大等缺點，大孔樹脂吸附法的重現性差、預處理麻煩，酶提取法、超臨界流體提取法都存在成本偏高的劣勢，只有超聲波輔助提取法能高效地提取蕨菜中的黃酮類物質，既能降低成本，又能縮短提取時間。但是對蕨菜黃酮的超聲波輔助提取未見報道，因此本研究以野生蕨菜為對象，采用單因素試驗與正交試驗相結合的方法，考察超聲波輔助提取野生蕨菜總黃酮的優選工藝及其清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的能力，以期為野生蕨菜的綜合開發利用提供依據。

1材料與方法

1.1材料

野生蕨菜，產自黑龍江伊春。

1.2試劑與儀器

蕓香苷標準品（純度>99%），購自成都市科龍化工試劑廠；DPPH，購自西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；亞硝酸鈉、無水乙醇、維生素C、硝酸鋁等，均為分析純。試驗用水均為二次蒸餾水。

KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-2500紫外-可見分光光度計，日本島津公司等。

1.3試驗方法

1.3.1野生蕨菜的預處理將野生蕨菜用蒸餾水洗凈，然后放于60 ℃烘箱中干燥，最后用粉碎機粉碎并過100目篩，裝瓶置于陰涼處備用。

1.3.2最大吸收波長的選擇野生蕨菜中的黃酮類物質中含有游離的羥基，在一定條件下能與金屬鋁離子形成金屬絡合物而顯色，所以本試驗中選擇硝酸鋁比色法測定野生蕨菜中的總黃酮含量[3]。

準確稱取100 mg蕓香苷標準品，置于50 mL容量瓶中，加約30 mL 50%乙醇，在水浴中加熱溶解，放冷，加50%乙醇稀釋到刻度，混合均勻，準確量取5 mL上述溶液于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，混合搖勻，即得0.100 mg/mL蕓香苷標準乙醇溶液。

準確量取2.0 mL蕓香苷標準溶液于25 mL比色管中，加入1.0 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混合搖勻，靜置6 min再加 1.0 mL 10%硝酸鋁溶液，混合均勻，靜置6 min，最后加 10.0 mL 4%氫氧化鈉溶液，加50%乙醇定容后，混合均勻，靜置15 min。取另一個比色管加1 mL 5%亞硝酸鈉，再加1 mL 10%硝酸鋁，最后加10 mL 4%氫氧化鈉，加50%乙醇定容至刻度作為空白對照，在200～800 nm波長范圍內進行紫外掃描，由圖1可見，在513 nm處有最大吸收峰，因此本試驗選擇513 nm為測定波長。

1.3.3蕓香苷標準曲線的繪制準確量取蕓香苷標準品乙醇溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL比色管中，加1.0 mL 5%亞酸鈉溶液，混合均勻， 靜置 6 min，

然后加1.0 mL 10%硝酸鋁溶液，混合均勻，靜置 6 min，再然后加10 mL 4%氫氧化鈉溶液，最后加50%乙醇定容到刻度，混合均勻，靜置15 min，在波長513 nm處測定吸光度。由圖2可知，回歸方程為A=10.993C-0.000 7，r2=0.997。結果表明，蕓香苷標準品濃度在4～24 μg/mL 范圍內，吸光度與濃度線性關系良好。

1.3.4樣品的測定[4]準確稱取1.000 0 g野生蕨菜于錐形瓶中，超聲提取，常壓過濾，用乙醇溶劑洗至濾液無色即得到待測液。準確移取2.0 mL野生蕨菜待測液于25 mL比色管中，用“1.3.2”節的顯色方法測定吸光度，代入標準方程計算野生蕨菜中總黃酮含量和提取率，其中總黃酮含量的計算公式：總黃酮含量=（提取液中總黃酮的質量/樣品質量）×100%。

1.3.5單因素試驗[5]（1）超聲功率對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響。準確稱取5份野生蕨菜粉末，每份 1.000 0 g，分別加入30 mL 70%（體積分數）乙醇，超聲溫度為50 ℃，分別在160、200、240、280、320 W的功率下超聲提取40 min，常壓過濾至濾液無色，測量提取液體積并取2.0 mL提取液于25 mL比色管中，采用硝酸鋁比色法測定溶液吸光度，計算蕨菜的總黃酮含量。

（2）料液比對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響。準確稱取5份野生蕨菜粉末，每份1.000 0 g，分別加入25、30、35、40、45 mL 70%（體積分數）乙醇，在超聲溫度為50 ℃、超聲功率為240 W的條件下超聲提取40 min，其余步驟同（1）。

（3）超聲時間對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響。準確稱取5份野生蕨菜粉末，每份1.000 0 g，分別加入30 mL 70%（體積分數）乙醇，分別在50 ℃超聲溫度、280 W超聲功率下超聲提取30、50、70、90、110 min，其余步驟同（1）。endprint

（4）乙醇濃度對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響。準確稱取5份野生蕨菜粉末，每份1.000 0 g，分別加入30 mL體積分數為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，在280 W超聲功率、50 ℃超聲溫度下超聲提取90 min，其余步驟同（1）。

（5）超聲溫度對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響。準確稱取5份野生蕨菜粉末，每份1.000 0 g，分別加入30 mL 60%（體積分數）乙醇，分別在25、30、40、50、60 ℃溫度下以280 W的超聲功率超聲提取70 min，其余步驟同（1）。

1.3.6正交試驗[6]在單因素基礎上，選取超聲功率、料液比、超聲時間、超聲溫度作為考察因素，以野生蕨菜中總黃酮含量為目標，每個因素設3個水平，采用L9（34）的正交設計試驗，因素水平設計如表1所示。

1.3.7野生蕨菜中總黃酮與維生素C分別清除DPPH自由基的測定（1）蕨菜總黃酮清除DPPH自由基測定。準確稱取25 mg DPPH，用無水乙醇定容于100 mL棕色容量瓶中，制得DPPH母液，于冰箱中避光保存，用時稀釋5倍，得 50 mg/mL DPPH溶液。另將野生蕨菜提取液分別配成 0.026 4、0.021 1、0.015 8、0.010 6、0.007 9、0.005 3、0.004 0、0.002 6、0.001 3 mg/mL 9個濃度，反應30 min后于1 cm比色皿中測定其在517 nm處的吸光度。

（2）維生素C清除DPPH自由基測定。準確稱取 26.4 mg VC，用60%乙醇溶液定容于50 mL容量瓶中，制得VC母液，取10 mL母液稀釋于50 mL容量瓶中，得 0.052 8 mg/mL VC溶液。VC濃度梯度與DPPH自由基清除試驗中蕨菜濃度一致，反應30 min后于1 cm玻璃比色皿中測定其在517 nm處的吸光度。

按下列公式計算DPPH自由基的清除率：清除率=[1-（Ds-Dc）/D0×100]×100%，其中抗氧化劑清除自由基能力采用清除率為50%時所對應的抗氧化劑溶液濃度（即IC50值）表示。式中：D0為4.0 mL 50 mg/L DPPH乙醇溶液+ 1.0 mL 60%乙醇溶液的吸光度；Ds為4.0 mL 50 mg/L DPPH乙醇溶液+1.0 mL不同濃度樣品溶液的吸光度；Dc為 4.0 mL 無水乙醇溶液+1.0 mL不同濃度樣品溶液的吸光度[7]。

2結果與分析

2.1單因素試驗分析

2.1.1超聲功率對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響如圖3所示，在160～240 W超聲功率范圍內，野生蕨菜中總黃酮的提取率緩慢升高；在240～280 W超聲功率范圍內，提取率迅速提高，在280 W超聲功率處理下，野生蕨菜中總黃酮的提取率達到最大值；但從280 W超聲功率開始，提取率急劇下降，這可能是因為超聲功率達到一定程度時會破壞黃酮類分子的結構，使黃酮含量降低[6]。因此，確定280 W為最佳超聲功率。

2.1.2料液比對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響如圖4所示，在料液比1 g ∶25 mL～1 g ∶30 mL的范圍內，野生蕨菜中總黃酮的提取率逐漸提高，但從料液比為1 g ∶30 mL開始，溶劑越多，野生蕨菜中總黃酮的提取率急劇降低。這可能是由于隨著溶劑的增多，所溶解的雜質也增多，從而使黃酮提取率降低。綜合提取效果與減少溶劑用量等方面[8]，確定最佳料液比為1 g ∶30 mL。

2.1.3超聲時間對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響如圖5所示，野生蕨菜中總黃酮的提取率隨著超聲時間的增加呈現先提高后降低的趨勢，這可能是由于過長的提取時間破壞了黃酮類化合物的結構，降低了總黃酮的含量。所以，確定最佳超聲時間為70 min。

2.1.4乙醇濃度對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響如圖6所示，野生蕨菜中總黃酮的提取率隨著乙醇濃度的增加呈現先提高后降低的趨勢，這可能是由于高濃度乙醇溶解了部分脂溶性化合物，導致溶解黃酮化合物的能力降低[5]。因此，確定最佳乙醇濃度為60%。

2.1.5超聲溫度對野生蕨菜中總黃酮提取率的影響如圖

7所示，野生蕨菜中總黃酮的提取率隨著超聲溫度的逐漸上升呈現先提高后降低的趨勢，這可能由于溫度過高，溶劑揮發，使得野生蕨菜中總黃酮提取率降低[5]。所以，確定50 ℃為最佳超聲溫度。

2.2正交試驗結果

根據表2正交試驗結果可知，各因素對野生蕨菜總黃酮提取率影響大小順序為D>A>C>B，即超聲溫度>超聲功率>超聲時間>料液比，野生蕨菜中總黃酮超聲提取最佳的條件組合為A1B3C2D3，即超聲功率240 W，料液比 1 g ∶35 mL，超聲時間70 min，超聲溫度60 ℃。由表3分析可知，顯著的影響因素是超聲功率和超聲溫度。

2.3驗證試驗

為了更好地考察正交試驗的最優工藝的穩定性，根據分析結果，選取最優提取條件即超聲功率240 W，料液比

2.4蕨菜中總黃酮與維生素C分別清除DPPH自由基

DPPH自由基作為一種十分穩定、能長時間保存的自由基，當它在適當的介質條件下會被還原[9-10]，消除了該自由基，溶液中化合物的顏色會由原來的紫色變成淡黃色[11]。

如表4、圖8所示，清除DPPH自由基的能力隨著維生素C質量濃度的增加在逐漸增強：當維生素C的質量濃度達到 0.021 1 mg/mL 時，維生素C的清除率達到75.83%，其清除能力也趨于穩定狀態，維生素C清除率達到IC50值所對應的濃度為 0.014 mg/mL。清除DPPH自由基的能力隨著蕨菜總黃酮質量濃度的增大而增強，當質量濃度達到 0.015 8 mg/mL 時，其清除率達到87.96%，且趨于穩定，野生蕨菜清除率達到IC50值所對應的濃度為 0.005 mg/mL[12-18]。因此表明，蕨菜中黃酮類化合物可以較好地清除DPPH自由基，同時也說明其清除能力比維生素C強。endprint