生酸棗仁總黃酮的提取及HPLC法同時(shí)測(cè)定斯皮諾素和6—阿魏酰斯皮諾素

張亞青+李莎+汪洋+孫夢(mèng)影+黃園園+趙仁邦

摘要：以生酸棗仁為原料，以總黃酮的提取量為指標(biāo)確定生酸棗仁中總黃酮的提取條件，并建立了一種同時(shí)測(cè)定生酸棗仁中斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素含量的高效液相色譜（HPLC）分析方法。利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，最終確定超聲提取法提取總黃酮的最佳條件為：料液比為1 g ∶50 mL，超聲時(shí)間為60 min，超聲功率為 270 W，乙醇濃度為50%。在此條件下，生酸棗仁中總黃酮的提取量為6.37 mg/g。測(cè)定的色譜條件為：COSMOSIL C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；梯度洗脫，流速為0.80 mL/min；柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm。斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素在50～500 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（r2=0.999，r2=0.999），平均加標(biāo)回收率為9996%和100.11%，最低檢出限為2.07 μg/mL和1.54 μg/mL。該方法靈敏度高，專屬性強(qiáng)，可用于生酸棗仁中斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：生酸棗仁；總黃酮；提取；HPLC；斯皮諾素；6-阿魏酰斯皮諾素

中圖分類號(hào)：R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）23-0198-05

酸棗仁總黃酮是酸棗仁的重要成分，現(xiàn)代藥理研究表明，它對(duì)動(dòng)物有著鎮(zhèn)靜催眠的作用，是酸棗仁中起鎮(zhèn)靜催眠作用的活性物質(zhì)之一[7]。而Li等的試驗(yàn)結(jié)果表明酸棗仁黃酮（主要是斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素）是酸棗仁中發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠的活性物質(zhì)之一[8]。鮑康德等曾采用高效液相色譜和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器聯(lián)用法（HPLC-ELSD）同時(shí)測(cè)定中藥酸棗仁中6種主要黃酮及皂苷類成分的含量[9]。閆艷等采用HPLC-DAD-ELSD法同時(shí)測(cè)定酸棗仁中斯皮諾素、酸棗仁皂苷A和B的含量[10]；劉昌輝等采用LC-MS/MS法測(cè)定酸棗仁中酸棗仁皂苷A、B和斯皮諾素的含量[11]。曾有人采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定酸棗仁顆粒[12]、酸棗仁湯[13]以及理?xiàng)椚蔥14]中的斯皮諾素含量，但是近年研究報(bào)道中未出現(xiàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定生酸棗仁中的斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素，所以筆者采用響應(yīng)面法優(yōu)化生酸棗仁中總黃酮提取條件，并首次采用HPLC法對(duì)生酸棗仁總黃酮中的主要成分斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素進(jìn)行含量測(cè)定，建立快速、靈敏、同時(shí)測(cè)定生酸棗仁中斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素的方法，以期為酸棗仁質(zhì)量控制提供簡(jiǎn)便快速的方法，為臨床使用生酸棗仁提供合理依據(jù)。

1儀器與試劑

1.1儀器

KQ 5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHD-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（保定高新區(qū)陽(yáng)光科教儀器廠）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；CP114電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；TD4-5K臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南長(zhǎng)沙易達(dá)儀器有限公司）；UV-5200PC紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；Waters 2998高效液相色譜儀（低壓梯度泵，PDA檢測(cè)器）（美國(guó)Waters 公司）；COSMOSIL C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（日本NACALAI公司）

1.2試劑

生酸棗仁，購(gòu)于河北省保定市安國(guó)藥材市場(chǎng)；無(wú)水乙醇（分析純），天津市天力化學(xué)試劑有限公司；石油醚（60～90 ℃，分析純），天津市富起化工有限公司；亞硝酸鈉（分析純），北京亞太龍興化工有限公司；硝酸鋁（分析純），天津市天力化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純），天津市天力化學(xué)試劑有限公司；蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；斯皮諾素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%），上海源葉生物科技有限公司；6-阿魏酰斯皮諾素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%），上海源葉生物科技有限公司；乙腈（色譜純），賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

2試驗(yàn)方法

2.1原料預(yù)處理

將潔凈的生酸棗仁用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，40目過(guò)篩，備用。

將干燥的生酸棗仁粉末置于索氏提取器中，用20倍量的石油醚（60～90 ℃）水浴回流提取3次，每次5 h，回收石油醚。將脫脂后的酸棗仁粉末揮盡殘留的石油醚至無(wú)醚味，混勻后于干燥器中密封備用。

2.2方法

2.2.1酸棗仁總黃酮含量測(cè)定采用紫外分光光度計(jì)法，以蕓香苷作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法[15]測(cè)定生酸棗仁中的總黃酮含量。

2.2.2樣品溶液的制備精確稱取脫脂后的生酸棗仁粉 1.0 g，置于100 mL三角瓶中，加入一定濃度適量乙醇溶液，浸泡45 min，超聲波提取，在5 000 r/min條件下，離心 15 min。旋蒸至1～2 mL，用95%乙醇定容至100 mL。將上述處理做3個(gè)平行。

2.2.3超聲波提取生酸棗仁中總黃酮單因素試驗(yàn)分別以超聲波提取時(shí)間、超聲功率、料液比、乙醇濃度進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

2.2.3.1超聲波提取時(shí)間單因素試驗(yàn)選取不同的超聲時(shí)間（20、30、40、50、60、70 min），50 mL 50%的乙醇溶液，200 W功率，按“2.2.2”節(jié)操作。

2.2.3.2超聲功率單因素試驗(yàn)選取不同的超聲功率（100、200、300、400、500 W），50 mL 50%的乙醇溶液，提取 20 min，按“2.2.2”節(jié)操作。

2.2.3.3料液比單因素試驗(yàn)選取不同的料液比（1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70，g ∶mL），50%的乙醇溶液，提取20 min，200 W功率，按“2.2.2”節(jié)操作。

2.2.3.4乙醇濃度單因素試驗(yàn)選取不同的乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%），50 mL乙醇溶液，提取 20 min，200 W功率，按“2.2.2”節(jié)操作。endprint

2.2.4響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件在單因素考察的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響提取的因素（超聲波提取時(shí)間、超聲功率、料液比、乙醇濃度）進(jìn)行優(yōu)化，以生酸棗仁中總黃酮提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按表1、表2進(jìn)行設(shè)計(jì)，篩選生酸棗仁中總黃酮提取的最佳工藝條件。

2.2.6提取次數(shù)的確定和最終得率計(jì)算選取本試驗(yàn)條件下最佳提取工藝，確定提取次數(shù)并計(jì)算總黃酮得率。結(jié)果與模擬結(jié)果比較，預(yù)測(cè)所建立的酸棗仁總黃酮提取工藝是否合理。

2.2.7HPLC法測(cè)定酸棗仁斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素的樣品前處理按上述試驗(yàn)所得的最佳試驗(yàn)條件對(duì)生酸棗仁中的總黃酮進(jìn)行提取，得到總黃酮提取液，濃縮至10 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，用于HPLC法測(cè)定。

2.2.8HPLC分析條件色譜柱：COSMOSIL C18色譜柱

2.2.9標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與曲線的繪制精確稱取1.00 mg斯皮諾素和1.00 mg 6-阿魏酰斯皮諾素，溶解于1 mL甲醇中，配置成濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液。精確吸取儲(chǔ)備液，分別稀釋成500、400、300、200、100、50 μg/mL，置于樣品瓶中，4 ℃ 保存。按照上述色譜條件進(jìn)行HPLC法測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行直線回歸，得到回歸方程。

3結(jié)果與分析

3.1超聲波提取單因素試驗(yàn)

3.1.1超聲波提取時(shí)間對(duì)生酸棗仁中總黃酮提取量的影響由圖1可知，生酸棗仁在不同的超聲波提取時(shí)間下測(cè)得的吸光度不同。在所選的水平中生酸棗仁中總黃酮的提取量呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，其中在60 min時(shí)吸光度達(dá)到最大值。所以，基于本單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇超聲時(shí)間60 min作為本試驗(yàn)條件下最優(yōu)提取時(shí)間。

3.1.2超聲功率對(duì)生酸棗仁中總黃酮提取量的影響由圖2可知，生酸棗仁在不同的超聲功率下測(cè)得的吸光度有所不同。在所選的水平中生酸棗仁中總黃酮的提取量呈現(xiàn)先上升后下降，最后趨于不變的趨勢(shì)，其中在200 W時(shí)吸光度達(dá)到最大值。所以，基于本單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇200 W作為本試驗(yàn)條件下最佳提取功率。

3.1.3料液比對(duì)生酸棗仁中總黃酮提取量的影響由圖3可知，生酸棗仁在不同的料液比下測(cè)得的吸光度有所不同。在所選的水平中，生酸棗仁中總黃酮的含量呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，其中在1 g ∶50 mL時(shí)吸光度達(dá)到最大值。所以，基于本單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇1 g ∶50 mL作為本試驗(yàn)條件下最佳提取料液比。

3.1.4乙醇濃度對(duì)生酸棗仁中總黃酮提取量的影響由圖4可知，生酸棗仁在不同的乙醇濃度下測(cè)得的吸光度有所不同。在所選的水平中生酸棗仁中總黃酮的提取量呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中在乙醇濃度為50%時(shí)，吸光度達(dá)到最大值。所以，基于本單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇50%乙醇作為本試驗(yàn)條件下最佳的提取溶液。

3.2響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析

生酸棗仁總黃酮的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。利用Design-Expert 8.0.5.0軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到表4。由表4可知，回歸模型具有高顯著性（P<0.001）。一次項(xiàng)A、C、D，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2，交互項(xiàng)AD、BC都表現(xiàn)出極顯著影響。該模型的R2=0.990 5、R2Adj=0.981 1，表明該模型能解釋98.11%響應(yīng)值的變化，擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，適合對(duì)生酸棗仁總黃酮的提取量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)；從模型的失擬性方差分析可以看出，失擬項(xiàng)為 0.066，不顯著（P>0.05），表明該模型是穩(wěn)定的，能很好地預(yù)測(cè)實(shí)際生酸棗仁中總黃酮含量的變化。通過(guò)F值大小可看出，影響生酸棗仁中總黃酮提取率的主次因素依次為C>A>D，即乙醇濃度>超聲功率>超聲時(shí)間。

采用逐步回歸法得到超聲功率、超聲時(shí)間、料液比、乙醇濃度4個(gè)影響因素與提取總黃酮的擬合方程：總黃酮含量=6.39+0.14A+0.000 083 33B+0.27C-0.11D-0.044AB+0.035AC+0.049AD-0.31BC-0.074BD+0.13CD-0.84A2-044B2-044C2-0.74D2。由響應(yīng)面分析得出的優(yōu)化結(jié)果，超聲功率269.94 W，料液比48.3 ℃，乙醇濃度53.91%，超聲時(shí)間59.95 min。按照模型給出的近似適宜提取條件（超聲功率270 W，料液比1 g ∶50 mL，乙醇濃度50%，超聲時(shí)間 60 min）進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，每個(gè)處理3次平行，得到生酸棗仁總黃酮的含量為（6.37±0.16）mg/g，略低于前人的試驗(yàn)結(jié)果（8.64 mg/g）[16]，這可能跟原料有關(guān)，與模型的理論差值為（0.12±0.01）mg/g。

3.4色譜條件的優(yōu)化

3.4.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇依據(jù)斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素的理化性質(zhì)，它們?cè)谧贤鈪^(qū)域有最大吸收，故取斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素對(duì)照品溶于甲醇后在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素在335 nm波長(zhǎng)處具有最大吸收，所以選取335 nm作為HPLC法測(cè)定斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素含量的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4.2流動(dòng)相的選擇色譜甲醇的最大吸收波長(zhǎng)為 210 nm，色譜乙腈的最大吸收波長(zhǎng)為190 nm，斯皮諾素和 6-阿魏酰斯皮諾素的最大吸收波長(zhǎng)在335 nm，為減少干擾，提高信噪比，選擇乙腈作為流動(dòng)相，可在消除背景干擾且保證基線較平穩(wěn)和檢測(cè)的靈敏度。試驗(yàn)過(guò)程中在流動(dòng)相中加入甲酸可減少色譜峰拖尾的情況，所以最終選擇加入了甲酸的乙腈-水體系。

3.4.3流動(dòng)相組成的選擇流動(dòng)相中有機(jī)相的比例越大，色譜峰的保留時(shí)間越短，色譜峰出峰越快。本試驗(yàn)在其他相同條件下，分別試驗(yàn)了乙腈的不同體積百分比下進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的分析。結(jié)果顯示，表3的洗脫程序下標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的分離效果最好，所以選擇本洗脫程序。endprint

3.4.4流動(dòng)相流速的選擇在色譜分離過(guò)程中，流動(dòng)相的流速大時(shí)，色譜柱柱壓升高，縮短了色譜柱的壽命。系統(tǒng)壓力增加，增大了泵的負(fù)荷，使泵損壞加快。流速過(guò)低， 待分離物質(zhì)

3.6HPLC 分析方法的評(píng)價(jià)

3.6.1方法的精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)取斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，在相同色譜條件下平行5次進(jìn)樣，以色譜峰的峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD，考察方法的精密度，斯皮諾素標(biāo)準(zhǔn)溶液的精密度試驗(yàn)RSD為0.49%，6-阿魏酰斯皮諾素標(biāo)準(zhǔn)溶液的精密度試驗(yàn)RSD為2.67%，說(shuō)明本方法具有良好的精密度；將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在室溫放置2、4、8、16、32 h后進(jìn)行HPLC測(cè)定，以色譜峰的峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD，考察其穩(wěn)定性，斯皮諾素標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD為0.82%，6-阿魏酰斯皮諾素標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD為3.45%，說(shuō)明本方法具有良好的穩(wěn)定性。

3.6.2回收率試驗(yàn)準(zhǔn)確平行稱取5份生酸棗仁樣品按“22.8”節(jié)色譜條件分析。另將同一水平的斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到同一樣品中，在相同條件下進(jìn)行分析測(cè)定，與未加標(biāo)樣品進(jìn)行含量比較，計(jì)算每份樣品的加標(biāo)回收率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，斯皮諾素的平均回收率為99.96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.69%；6-阿魏酰斯皮諾素的平均回收率為100.11%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.23%。

從方法評(píng)價(jià)的結(jié)果來(lái)看，此方法具有較好的精密度、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度，可用于生酸棗仁中斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素的含量分析。

3.7樣品色譜圖和含量分析

按照“2.2.8”節(jié)所述分析方法對(duì)生酸棗仁中的斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素的含量進(jìn)行分析，斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖見圖8。

根據(jù)表5所給出的標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品中2種物質(zhì)的峰面積計(jì)算得出生酸棗仁中斯皮諾素的含量為3.48 mg/g，6-阿魏酰斯皮諾素的含量為2.24 mg/g，略高于前人試驗(yàn)結(jié)果[17]。

4結(jié)論

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化總黃酮提取工藝。由響應(yīng)面分析得出的優(yōu)化結(jié)果是：超聲功率270 W，料液比 1 g ∶50 mL，乙醇濃度50%，超聲時(shí)間60 min提取2次。此條件下生酸棗仁中總黃酮提取量達(dá)6.37 mg/g。

本試驗(yàn)開發(fā)了一種梯度淋洗高效液相色譜分析法，用于生酸棗仁中斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素的定量分析可以獲得比較滿意的分析結(jié)果。通過(guò)對(duì)生酸棗仁中斯皮諾素和6-阿魏酰斯皮諾素進(jìn)行HPLC測(cè)定得出酸棗仁中中斯皮諾素的含量為3.48 mg/g，6-阿魏酰斯皮諾素的含量為 2.24 mg/g。

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