枯草芽孢桿菌和綠色木霉對落葉及草坪碎屑腐解的影響

王楠+劉鑌嫻+徐偉宸+高立支+李松松+崔悅+王帥

摘要：落葉及草坪碎屑是園林生態系統中最常見的有機固體廢棄物，通過腐解可轉化成優質有機物料供園林綠化使用。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、綠色木霉（Trichoderma viride）是堆肥腐解常用的有益菌群，在促進腐殖化進程方面有著不同的效果。采用室內培養法，通過接種2類菌株懸液，揭示其在60 d培養期間對落葉及草坪碎屑混料腐解的動態差異。結果表明：綠色木霉在礦化混料總有機碳方面的能力要強于枯草芽孢桿菌；混料經綠色木霉腐解后，其P2O5含量可獲得較大程度提升，相反，枯草芽孢桿菌對于混料N及K2O含量的促進作用更為明顯；綠色木霉對于混料可提取腐殖酸碳含量（CHE）的利用程度較差，但對胡敏素碳含量（CHu）的礦化能力更強；2類微生物皆有利于混料腐殖質品質的提升，其中枯草芽孢桿菌的作用更為明顯。本研究結果可為闡明落葉及草坪碎屑的腐解特征及篩選高效微生物菌群提供技術參考。

關鍵詞：落葉；草坪碎屑；腐解；枯草芽孢桿菌；綠色木霉

中圖分類號： S182文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0258-04

畢延剛等指出，在堆肥進程接種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）可使堆料對枯萎病病原菌產生抑制作用[4]，此外，（Bacillus subtilis）也可加速物料的腐解進程，且對其中的生物毒性物質有降解作用[5]。李瑜等研究表明，由綠色木霉（Trichoderma viride）產生的纖維素酶活性較高，當其與枯草芽孢桿菌組成復合菌劑時，通過兩者間比例的調整可有效縮短堆肥周期[6]。有學者利用微生物預處理手段，基于菌劑與混料基質間的不同比例（1 ∶19、1 ∶9、1 ∶4），將蟲擬蠟菌（Ceriporiopsis subvermispora）接種于園林混料基質中，并在 30 d 培養時間內探討混料木質素、纖維素、半纖維素及干物質的降解程度，并指出在此過程有甲烷氣體產生[7-8]。Awasthi等研究了由黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）、綠色木霉（T. viride）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）所組成的混合菌劑在園林、農業及城市固體廢棄物與木屑所組成混合物料中的堆肥效果，結果表明，在堆肥過程中，物料淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶及脫氫酶等活性均有所提升，且堆肥過程可縮減至4周以內[9]。可見，配伍適宜的混合微生物菌劑對堆肥品質的提升有所幫助。

Bacillus subtilis和Trichoderma viride對于堆肥過程具有較好的促進作用且功能不同。當前研究中，腐解物料多以農業廢棄物及城市污泥為主，對于落葉及草坪碎屑等園林廢棄物的堆腐研究尚缺乏系統性報道，而對于微生物菌劑的研究多集中于復合菌。本研究擬采用室內培養法，將落葉與草坪碎屑按照2 ∶8的質量比混合，通過Bacillus subtilis和Trichoderma viride接種，對其總有機碳、養分性狀及腐殖質組成進行動態分析，并揭示2類微生物在園林廢棄物腐解特征上的差異，旨在為園林固體廢棄物的資源化利用及高效菌劑的篩選提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

落葉于2015年10月取自吉林農業科技學院校內園林綠地，所屬區域以栽植銀中楊、垂柳及玉簪等地被植物為主。將收集好的袋裝落葉帶回實驗室，剔除多余枯枝、保留落葉，105 ℃ 下作殺青處理，再在55 ℃下烘干至恒質量，粉碎過 1 mm 篩。經測定，落葉粉末中的總有機碳（TOC）、全氮（N）、全磷（P2O5）及全鉀（K2O）含量分別為58.3%、2.24%、1.00%、0.77%。

草坪碎屑于2015年9月取自吉林農業科技學院A座教學樓前草坪綠地，草種由狗牙根、早熟禾屬及羊茅屬組成。將經旋刀式剪草機剔除的碎草屑帶回實驗室，重復上述步驟，但不作粉碎處理，僅用剪刀將碎草屑繼續剪碎至0.20～0.25 cm 小段，隨后將其保存于玻璃干燥器中。經測定，草坪碎屑中TOC、N、P2O5、K2O含量分別為58.4%、2.68%、120%、2.09%。

綠色木霉（Trichoderma viride，Tv），水谷欣品牌，江蘇省鹽城市神微生物菌種科技有限公司，原粉粉劑，50億活孢子/g；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，Bs），水谷欣品牌，江蘇省鹽城市神微生物菌種科技有限公司，粉劑，300億/g。菌株懸液的制備方法：稱取菌粉5.0 g置于100 mL離心管中，注入 100 mL 無菌水后以3 500 r/min的轉速離心10 min，將固液分離，收集菌株懸液，無菌條件下保存，以防染雜菌。

1.2方法

將落葉粉末按照2 ∶8的質量比與草坪碎屑進行混合，稱取20 g混料于100 mL錐形瓶中，隨后用（NH4）2SO4溶液調節瓶裝混料，使其C/N比為22.5 ∶1、含水量為50%，蓋好自制防菌棉塞，高壓蒸汽滅菌（121 ℃，20 min）、自然冷卻后，分別接種5 mL綠色木霉或5 mL枯草芽孢桿菌懸液，隨后用塑料薄膜封口，28 ℃條件下恒濕培養60 d，其間分別于0、15、30、60 d取樣，每個處理重復3次。

采用H2SO4-H2O2消化、凱氏蒸餾法測定混料N含量，采用H2SO4-H2O2消化、釩鉬黃比色法測定P2O5含量，采用H2SO4-H2O2消化、火焰光度法測定K2O含量，采用重鉻酸鉀氧化法測定TOC含量，具體過程參照NY 525—2012《有機肥料》農業行業標準。

采用腐殖質組成修改法對腐殖質各組分進行分離、測定。首先用70 ℃蒸餾水浸提混料中的水溶性有機碳（WSOC），隨后用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L Na4P2O7的混合堿溶液浸提可提取腐殖酸（HE），再用0.5 mol/L H2SO4從中分離胡敏酸（HA）和富里酸（FA），兩者碳含量比值即為腐殖化系數。將提取HE后的沉淀物質用蒸餾水多次洗滌，直至洗出液近中性為止，將沉淀置于55 ℃鼓風干燥48 h，該殘渣物質即為胡敏素（Hu）。HE、HA、FA、Hu組分的碳含量分別用CHE、CHA、CFA、CHu表示，均用重鉻酸鉀氧化法測定。endprint

采用T6新世紀紫外可見分光光度計（北京譜析通用有限公司）對HA堿溶液的吸光度（D400 nm、D465 nm、D600 nm、D665 nm）進行測定，并由此計算出光密度值（E4/E6）和色調系數（ΔlgK），具體計算方法如下：

E4/E6=D465 nm/D665 nm；（1）

ΔlgK=lgD400 nm-lgD600 nm。（2）

1.3數據分析

采用Excel 2003及SPSS 18.0軟件對數據進行差異性分析。

2結果與分析

2.1綠色木霉和枯草芽孢桿菌對混料總有機碳含量的動態影響

由圖1可見，綠色木霉（Tv）和枯草芽孢桿菌（Bs）接種后，前者使混料初始總有機碳（TOC）含量大于后者。培養期間，受Tv、Bs影響，混料TOC含量均呈先增加后下降的規律，培養結束后，TOC含量皆有所損失，Tv處理下的降低幅度更為明顯，達到8.6%。上述規律表明，與枯草芽孢桿菌相比，綠色木霉菌株懸液中含有更多的有機碳成分，歷經15 d培養，物料失重幅度大于TOC的礦化程度，因此，物料中TOC含量反而呈上升趨勢，表現為濃縮效應，隨著培養進行，有機碳礦化程度加劇直至培養結束，綠色木霉對于物料TOC的礦化程度要大于枯草芽孢桿菌。

2.2綠色木霉和枯草芽孢桿菌對混料全量養分的動態影響

由表1可見，接種Tv和Bs可對堆腐過程混料的全量養分產生較為顯著的動態影響。Tv菌株懸液中含有比Bs更多的N和K2O，反之，Bs菌株懸液則含有更多的P2O5。隨著培養的進行，混料N、P2O5、K2O含量均呈增加趨勢。經過 60 d 培養，Tv和Bs處理下混料N含量的增幅分別為10.6%、32.0%，P2O5含量增幅為101.6%、15.1%，K2O含量增幅為39.6%、72.8%。由此可見，混料在培養過程中質量的缺失，即減重效應，會變相增加全量養分的含量，Tv菌株懸液中含有更多的N和K2O，而P2O5含量稍遜于Bs。培養結束后，綠色木霉對于混料P2O5含量的增加幅度較大，而后者歸屬細菌在培養過程中繁殖速率較快[10]，因此更有益于混料N和K2O的含量增加。

2.3綠色木霉和枯草芽孢桿菌對混料腐殖質組成的動態影響

如圖2-A所示，盡管Tv和Bs的培養對于混料WSOC含量有所促進，但影響規律不同，具體來看，培養15 d期間，Tv對于混料WSOC組分的利用程度較高，使其含量有所降低，而后隨Tv對腐殖質其他組分降解以及物料失重的影響，WSOC含量再度提高，增幅達42.3%。在添加Bs條件下，盡管Bs必然會對WSOC組分加以利用，但對于物料失重的影響更為顯著，間接使得WSOC含量增加，歷經60 d培養，最終該組分碳含量增加幅度達41.3%。由圖2-B可知，無論接種Tv還是Bs，混料CHE均呈先增加后降低的變化規律，培養結束后，CHE均遭致損失，在Tv和Bs處理下，CHE的降低幅度分別達到8.6%和15.7%，可推斷，微生物首先利用WSOC組分并展開對腐殖質組分的降解，加之混料失重，兩過程均促使CHE增加，而后隨著培養進行，部分CHE組分亦可被微生物降解，使其碳含量有所下降，在此過程，枯草芽孢桿菌的作用更為明顯。圖2-C描述了混料CHA變化，在此之前，筆者已經明確CHE（CHA+CFA）在培養結束后會有所下降的規律，而其中的CHA卻被提升，可見，接種Tv和Bs均對落葉及草坪碎屑混料CHA的形成有促進作用。

培養條件下歷經不同變化規律：Tv處理下該組分碳含量漸趨降低，Bs處理下該組分碳含量先增后減。培養結束后，混料CHu均遭受損失，可見，綠色木霉對于落葉及草坪碎屑混料中惰性腐殖質組分的降解能力要優于枯草芽孢桿菌。

2.4綠色木霉和枯草芽孢桿菌對混料腐殖化系數（CHA/CFA）的影響

如圖3所示，無論接種Tv還是Bs，60 d培養結束后，混料CHA/CFA均有不同程度增加，從增加幅度來看，Bs處理有著更大優勢，CHA/CFA增幅達到67.4%，而在Tv處理下的增幅僅為25.9%。上述規律表明，：綠色木霉和枯草芽孢桿菌在培養 60 d 內均可提高混料腐殖化系數，使得落葉及草坪碎屑混料富里酸向胡敏酸轉化，盡管腐殖質活性有所減弱，但在此過程中腐殖質品質可獲得提升，其中枯草芽孢桿菌的優勢更為明顯。

2.5綠色木霉和枯草芽孢桿菌對混料胡敏酸堿溶液光學性質（E4/E6、ΔlgK）的影響

由圖4-A可知，接種Tv處理下，混料HA堿溶液的 E4/E6 經歷了先增后減的變化，與其相反，接種Bs后，E4/E6先減后增，總體看來，2個處理均可促使E4/E6增加，相較而言，Tv對其促進作用更為明顯，增幅達20.9%。由圖4-B可知，在Bs處理下ΔlgK的變化規律與E4/E6相同，而Tv處理下的ΔlgK則歷經漸趨增高的趨勢，培養結束后， 2個處理下

ΔlgK值均有所增加。

一般來講，HA堿溶液的E4/E6和ΔlgK越高，表明其數均分子量越小，分子結構越簡單，反之，則其腐殖質分子量越高，縮合度和芳構化程度愈高[11]。依據該原理可作推斷，Tv和Bs均有助于混料HA分子的簡單化，其中Tv的優勢更為明顯。

3結論與討論

綠色木霉為半知菌類，產孢量大、環境適應性強，其在生長過程不斷向胞外分泌蛋白酶類物質，該酶活性的強弱反映了菌絲體生長過程中對外界復雜有機物的分解能力[12]，此外還能產生3種纖維素酶且均為胞外酶， 對纖維素的降解能力

更強[13]。因此，在本試驗條件下，綠色木霉在充分供應氮素情況下，在礦化混料TOC方面的能力要比枯草芽孢桿菌更有優勢。接種綠色木霉后混料的TOC含量大于同條件下接種枯草芽孢桿菌的處理結果，這表明前者菌株懸液中含有更多的微生物量碳，使得起始TOC含量略大。接種2類菌株懸液后，混料TOC含量的變化趨勢相似，均表現為先升高后降低的規律，最終TOC含量均有不同程度損失，這與徐慶賢等的研究結論[14]有相似之處。經過2類菌株的培養，15 d后混料失重程度大于TOC的礦化程度，因濃縮效應的產生使TOC含量有所增高。隨著培養時間延長，TOC礦化程度加劇，比照培養前后混料TOC的差異可知，綠色木霉對混料的礦化、分解能力要大于枯草芽孢桿菌。endprint

混料經綠色木霉腐解后，其P2O5含量有所增加，而枯草芽孢桿菌對混料N及K2O含量的促進作用更為明顯。接種后，菌株在新培養環境下消耗營養物質來完成生命活動，致使物料失重，當失重速率超過養分降低速率時會出現營養物質濃縮的現象，最終使其含量增加[7-8]。綠色木霉懸液中含有更多N和K2O，對P2O5的利用程度相對較弱，因此，失重后更有利于P2O5含量的增加，同理，枯草芽孢桿菌含有更多P2O5，在繁殖過程對N和K2O的利用程度較弱，最終使物料中2種養分得以濃縮[15]。

綠色木霉對于混料CHE的利用程度較差，僅為 8.6%，但其對CHu的降解能力更強。在2類菌株培養條件下，混料CHE先略有增加而后大幅度降低，相比之下，枯草芽孢桿菌對于堆料CHE的利用程度更強，但對于CHu的降解效果并不明顯，這與朱偉寧等研究結論[16]相似。

胡敏酸和富里酸是腐殖酸的兩大核心組分，兩者皆為生物學穩定性物質[17]，兩者之比即腐殖化系數，在很大程度上決定了腐殖質的品質[18]。經過60 d培養，混料胡敏酸有向富里酸縮合的趨勢，在此過程中，枯草芽孢桿菌接種培養下CHA/CFA增加了67.4%，而綠色木霉培養下的CHA/CFA增加幅度僅為25.9%。可見，2類菌株皆有助于落葉及草坪碎屑混料腐殖質品質的改善，其中枯草芽孢桿菌的作用效果更佳。

從HA堿溶液E4/E6和ΔlgK的變化趨勢可知，2類菌株均有助于混料HA分子的簡單化，通過對HA組分實施降解而使其芳構化程度減弱、脂族碳含量增加，在此過程中，綠色木霉的優勢更大，這與趙愷凝等的報道結果[15]一致。受到枯草芽孢桿菌影響，混料HA分子結構先復雜而后漸變簡單，在此過程中，混料WSOC含量、CHE、CHA、CHu均有所增加，綜合考慮是因為物料失重、水浮物（用水浸提WSOC組分時被濾紙阻隔在外的、尚未完全降解的植株殘體）降解導致HA分子復雜化，而后隨WSOC縮合以及HA降解，最終使該分子結構向簡單化方向發展。而在綠色木霉影響下，混料WSOC組分可發生部分縮合[19]，加之對HA的礦化，盡管對Hu組分也有所降解，但所得有機分子片段并沒有扭轉HA分子向簡單化方向發展的趨勢。

參考文獻：

[1]張慶費，辛雅芬. 城市枯枝落葉的生態功能與利用[J]. 上海建設科技，2005（2）：40-41，55.

[2]王安嬌. 城市園林植物廢棄枝葉分解利用研究[D]. 福州：福建農林大學，2010.

[3]梅麗娜，姚拓，劉雯雯，等. 接種外源微生物對蘑菇渣堆肥的影響[J]. 草原與草坪，2010，30（4）：81-84.

[4]畢延剛，田永強. 堆肥和枯草芽孢桿菌協同調控黃瓜幼苗生長的機制探究[J]. 中國農學通報，2015，31（28）：71-78.

[5]劉悅秋，劉克鋒，石愛平，等. 生活垃圾堆肥優良菌劑的篩選[J]. 農業環境科學學報，2003，22（5）：597-601.

[6]李瑜，王琦，陳五嶺. 牛糞堆肥高效降解菌的篩選及復合微生物菌劑的制備[J]. 安徽農業科學，2008，36（35）：15653-15655.

[7]Zhao J，Ge X，Vasco correa J，et al. Fungal pretreatment of unsterilized yard trimmings for enhanced methane production by solid-state anaerobic digestion[J]. Bioresource Technology，2014，158：248-252.

[8]Xu F，Wang F，Lin L，et al. Comparison of digestate from solid anaerobic digesters and dewatered effluent from liquid anaerobic digesters as inocula for solid state anaerobic digestion of yard trimmings[J]. Bioresource Technology，2016，200：753-760.

[9]Awasthi M K，Pandey A K，Bundela P S，et al. Co-composting of organic fraction of municipal solid waste mixed with different bulking waste：characterization of physicochemical parameters and microbial enzymatic dynamic[J]. Bioresource Technology，2015，182：200-207.

[10]劉佳，李婉，許修宏，等. 接種纖維素降解菌對牛糞堆肥微生物群落的影響[J]. 環境科學，2011，32（10）：3073-3081.

[11]王帥，李昕洋，于楠楠，等. 不同玉米栽培模式對中溫帶典型暗棕壤腐殖質組成的短期影響[J]. 東北林業大學學報，2016，44（4）：54-59.

[12]王勇，高葦，張春祥，等. 液體培養條件下綠色木霉Tr9701

胞外酶及還原糖動態變化研究[J]. 華北農學報，2015，30（4）：226-230.

[13]姜伯玲，王曙陽，李文建，等. 綠色木霉與黑曲霉混合發酵產纖維素酶的研究[J]. 中國釀造，2015，34（7）：28-31.

[14]徐慶賢，官雪芳，林碧芬，等. 幾株豬糞堆肥發酵菌對堆肥發酵的促進作用[J]. 生態與農村環境學報，2013，29（2）：253-259.

[15]趙愷凝，趙國柱，國輝，等. 園林廢棄物堆肥化技術中微生物菌劑的功能與作用[J]. 生物技術通報，2016，32（1）：41-48.

[16]朱偉寧. 不同微生物形成類腐殖物質固碳研究[D]. 長春：吉林農業大學，2012.

[17]Said-Pullicino D，Kaiser K，Guggenberger G，et al. Changes in the chemical composition of water-extractable organic matter during composting：distribution between stable and labile organic matter pools[J]. Chemosphere，2007，66（11）：2166-2176.

[18]劉佳. 園林廢棄物堆肥化研究及應用[D]. 天津：天津城市建設學院，2012.

[19]王曉平. 真菌利用農業廢棄物形成穩定性腐殖質碳的研究[D]. 長春：吉林農業大學，2012.江蘇農業科學2017年第45卷第23期莊艷，楊程. 淹水條件下石灰對不同水稻土壤無機氮和N2O排放的影響[J]. 江蘇農業科學，2017，45（23）：262-266.endprint