木霉菌發酵培養基響應面優化

丁志雯+胡永紅+楊文革

摘要：為了優化木霉菌YHWG5102發酵培養基，以對水稻紋枯病的抑菌圈直徑大小為優化的指標，在單因素試驗的基礎上進行Plackett-Burman試驗和中心組合試驗設計，采用響應面法建立發酵培養基的優化模型。結果表明，得到最優培養基配方：23.44 g/L葡萄糖、26.07 g/L玉米漿、0.81 g/L K2HPO4。經試驗驗證，在此培養基條件下，木霉菌YHWG5102抑菌圈直徑達27.19 mm，比優化前提高約42%。

關鍵詞：木霉菌；發酵培養基；最優培養基配方；水稻紋枯病；響應面法

中圖分類號： S188+.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0275-04

1材料與方法

1.1菌種

木霉菌YHWG5102、水稻紋枯病病菌，均由筆者所在課題組保藏。

1.2培養基

活化培養基：200 g/L馬鈴薯，20 g/L蔗糖，15～20 g/L瓊脂，pH值自然。

種子培養基：20 g/L蔗糖，11.16 g/L酵母浸粉，0.5 g/L K2HPO4，1 g/L MgSO4，pH值6.5。

發酵培養基：20 g/L蔗糖，11.16 g/L酵母浸粉，0.5 g/L K2HPO4，1 g/L MgSO4，pH值6.5。

1.3主要試劑與儀器

瓊脂粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、肌醇、蛋白胨、酵母浸粉、尿素，購自國藥集團化學試劑有限公司；（NH4）2SO4、NaCl、CaCl2、FeSO4、MgSO4、K2HPO4，購自廣東省汕頭市西隴化工廠；工業用玉米漿與馬鈴薯，市售。

電熱恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠；滅菌鍋，廣州市華粵行儀器有限公司；醫用凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；鼓風電熱恒溫干燥箱，上海試驗儀器廠有限公司；真空抽濾機，河南省予華儀器有限公司；電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器（中國）有限公司；基礎分析型純水機，青島富勒姆科技有限公司。

1.4試驗方法

1.4.1菌種培養（1）平板活化：從甘油管中將菌種接到活化培養基上，26 ℃恒溫培養，培養6～7 d；（2）種子液培養：在500 mL錐形瓶中裝100 mL種子培養基，從平板上挑取菌落接種于搖瓶中，培養溫度26 ℃，搖床轉速120 r/min，培養3 d后進行接種發酵；（3）搖瓶發酵培養：在500 mL錐形瓶中裝100 mL發酵培養基，向培養基中接種2 mL種子液，培養溫度26 ℃，搖床轉速120 r/min。

1.4.2木霉菌抑菌圈直徑的測定采用牛津杯法進行抑菌試驗，將發酵液經抽濾、微濾（0.45 μm）后取濾液，對水稻紋枯病進行抑菌試驗，根據抑菌圈直徑確定抑菌能力。

1.4.3單因素試驗設計分別對不同種類的碳源、氮源、無機鹽進行優化，配制發酵培養基，26 ℃發酵培養4.5 d，測定每種因素對抑菌圈直徑的影響，選擇最佳培養基成分。

1.4.4響應面試驗設計（1）Plackett-Burman（PB）設計試驗：利用Plackett-Burman試驗從多個單因素中篩選出對抑菌直徑影響最顯著的幾個因素，使用Design Expert軟件設計試驗方案，包括11個變量（n=11），其中9個為主要變量（葡萄糖含量、麥芽糖含量、蔗糖含量、蛋白胨含量、玉米漿含量、酵母浸粉含量、K2HPO4含量、MgSO4含量、FeSO4含量），2個為虛擬變量，分別用A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K代表以上變量，每個變量有高（+）、低（-）2個水平（表1）。

（2）最陡爬坡試驗：最陡爬坡試驗在PB試驗中得到影響較為顯著的3類因素，并且根據PB設計得出的一次項擬合方程中相應變量的系數，從而確定變化梯度、爬坡方向。若變量系數為負，則該變量水平以梯度遞減的方向進行爬坡試驗。

（3）響應面法分析：經過最陡爬坡試驗，逼近抑菌圈直徑最大化區域，根據Box-Bellnken原理，對經過PB和爬坡試驗的變量進行5水平試驗（-1.68、-1、0、+1、-1.68），共20組試驗，使用Design-Expert軟件對試驗結果進行分析，研究木霉菌YHWG5102次級代謝產物中抑菌物質量含量最高的發酵培養基配方。

2結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1不同種類的碳源對抑菌圈大小的影響碳源是構成菌體的基本骨架，是菌體生長的能量來源，通過影響菌體的呼吸、能量供給、生長及相關代謝最終影響抗生素等次級代謝產物的產量[7]。由圖1可知，在選擇的5種碳源中，葡萄糖、蔗糖和麥芽糖對木霉菌抑菌效果的影響較為明顯，其中葡萄糖效果最好。因此，在下個階段的PB設計中，將葡萄糖、蔗糖及麥芽糖作為考察因素。

2.1.2不同種類的氮源對抑菌圈大小的影響氮源在合成菌體各種初級、次級代謝產物等含氮物質的過程中發揮著重要作用，同時在發酵生產中氮源起著調節菌體的生長及生物量的作用[8]。以上一步試驗得出的最優碳源葡萄糖作為本步試驗的初始碳源。由圖2可知，木霉菌不僅可以利用有機氮源，也可利用無機氮源，玉米漿、蛋白胨和（NH4）2SO4對抑菌圈直徑影響較大，其中玉米漿效果最佳。

2.1.3不同種類的無機鹽對抑菌圈大小的影響無機鹽是微生物生命活動中必不可少的一類營養物質，它們在機體中的生理功能主要是作為酶的活性中心的組成部分、維持細胞結構的穩定性等。以上述試驗得出的最優碳源葡萄糖及最優氮源玉米漿作為本步試驗的初始碳源與氮源。由圖3可知，K2HPO4對抑菌圈直徑影響最為明顯，這可能由于鉀是合成次級代謝產物中具有抑菌活性物質的關鍵元素，MgSO4、FeSO4的抑菌圈直徑次之。

2.2響應面設計

2.2.1Plackett-Burman設計試驗通過單因素試驗表明，在木霉菌抑菌試驗中，對其影響較大的9個變量為葡萄糖含量、蔗糖含量、麥芽糖含量、玉米漿含量、蛋白胨含量、（NH4）2SO4含量、K2HPO4含量、MgSO4含量和FeSO4含量，再加上2個虛擬變量，每個變量有高（+）、低（-）2個水平，采用Design-Expert軟件設計試驗，共計12組試驗（表2）。使用Design-Expert對表2進行分析，得到Plackett-Burman設計方差分析結果。由表3可知，上述9個因素對抑菌圈大小的影響程度排序為葡萄糖含量>蔗糖含量>麥芽糖含量>玉米漿含量>K2HPO4含量>MgSO4含量>FeSO4含量>蛋白胨含量>酵母浸粉含量，其中葡萄糖含量為顯著因素。該模型R2=0.999 7，表示99.97%的試驗數據可用該模型來解釋；從9個因素中選出對抑菌圈直徑影響顯著（P<0.05）的3類因素（葡萄糖含量、玉米漿含量、K2HPO4含量）進行下一步優化。endprint

2.2.2最陡爬坡試驗根據PB試驗結果，葡萄糖含量、玉米漿含量、K2HPO4含量的模型方程系數為正值，進行正爬坡。由表4可知，第4組試驗方案對應的抑菌圈直徑達到最大值，以此值為中心進行響應面試驗，這樣響應面方程才能充分逼近真實值。

2.2.3響應面法分析經過Plackett-Burman試驗和爬坡試驗，確定葡萄糖含量、玉米漿含量、K2HPO4含量的水平（表5），利用Design-Expert軟件設計響應面試驗，結果見表6。

3結論與展望

在單因素試驗的基礎上，經Plackett-Burman試驗確定了葡萄糖、玉米漿和K2HPO4為主要影響因素，在此基礎上，進行最陡爬坡試驗，確定最佳響應面區域，然后采用中心組合試驗設計和Design Expert軟件分析計算，得到這3種因素的最佳添加量：23.44 g/L葡萄糖、26.07 g/L玉米漿、0.81 g/L K2HPO4。在此發酵培養基下重復進行3次驗證試驗，結果表明，木霉菌YHWG5102對水稻紋枯病的抑菌圈直徑實測平均值為27.19 mm，與未優化的培養基初始抑菌圈直徑（約為19.1 mm）相比增加約42%。

然而此研究僅限于搖瓶發酵， 很多因素（如溶氧、通氣量表7回歸方程方差分析結果

等）難以有效控制，下一步可以上罐分批發酵，進一步優化木霉菌的培養條件，盡可能提高木霉菌次級代謝產物中具有抑菌作用的物質含量，然后通過硫酸銨分級沉淀、凝膠過濾層析以及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）初步確定具有抑菌作用的物質[9-10]，以期得到更穩定、高效的新型木霉菌制劑。

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