屠宰廢水中抗生素抗性基因在廢水處理各工藝中去除與累積效果的研究

摘要：為探討屠宰廢水中抗生素抗性基因去除最佳處理工藝，采用熒光定量（PCR）技術檢測屠宰廢水處理工程各個環節中sul1、sul2、tetA、tetB和tetC等5種抗生素抗性基因絕對含量和相對豐度。結果表明，厭氧處理工藝和氧化塘工藝可以通過減少微生物生物量降低抗生素抗性基因的絕對含量，但也可以導致部分抗生素抗性基因相對豐度上升，而表面流人工濕地對于屠宰廢水中抗生素抗性基因有有效的處理效果。

關鍵詞：屠宰廢水；抗生素抗性基因；PCR；表面流人工濕地

中圖分類號： X703文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0292-04

收稿日期：2016-07-13

本研究以2種磺胺類抗性基因（sul1、sul2）和3種四環素類抗性基因（tetA、tetB和tetC）為研究對象，研究了其在屠宰廢水處理工程中各個環節的絕對含量和相對豐度變化情況，以期尋找到最佳的抗生素抗性基因處理工藝，為相關企事業單位優化設計污水處理工藝提供理論依據，為浙江省“五水共治”提供技術支持。

1材料與方法

1.1水樣來源

水樣樣品來源于浙江中法農業科技發展有限公司屠宰廢水處理工程，其工程按流程包括3 000 m3厭氧沼氣池、3 600 m3 潛流人工濕地、3 600 m3氧化塘和18 hm2表面流人工濕地等4個主要處理環節。按照廢水處理流程選取了屠宰廢水原水（即厭氧沼氣池入水，采樣點編號W1）、厭氧沼氣池出水（即潛流人工濕地入水，采樣點編號W2）、潛流人工濕地出水（即氧化塘入水，采樣點編號W3）、氧化塘出水（即表面流人工濕地入水，采樣點編號W4）、表面流人工濕地出水（即工程最終出水，采樣點編號W5）等5個采樣點，樣品常溫采集，保存于4 ℃環境，采樣時間為2014年6月至2016年5月，每月下旬采樣1次。

1.2實驗試劑

TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffe、MgCl2、dNTP、DNA Marker、6×DNA Loading Dye、10×TAE、土壤基因組DNA快速抽提試劑盒、溴化乙錠、柱式DNA膠回收試劑盒、一步法快速感受態細胞制備試劑盒、SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒，以上均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。pMD 18-T Vector，購于寶生物工程（大連）有限公司。引物合成于生工生物工程（上海）股份有限公司，序列[1]為：sul1-F：CACCGGAAACATCGCTGCA，sul1-R：AAGTTCCGCCGCAA GGCT，sul2-F：CTCCGATGGAGGCCGGTAT，sul2-R：GGGA ATGCCATCTGCCTTGA，tetA-F：GCTACATCCTGCTTGCCTTC，tetA-R：CATAGATCGCCGTGAAGAGG，tetB-F：CGAAGTAGG

GGTTGAGACGC，tetB-R：AGACCAAGACCCGCTAATGAA，tetC-F：TGCGTTGATGCAATTTCTATGC，tetC-R：GGAATGGT

GCATGCAAGGAG，16S rRNA-338F：ACTCCTACGGGAGGCA

GCAG，16S rRNA-518R：ATTACCGCGGCTGCTGG。

1.3試驗儀器

潔凈工作臺、穩壓穩流電泳儀、高速冷凍離心機、凝膠成像系統、微型電泳槽、PCR反應擴增儀、紫外分光光度計、微量移液器、3730XL測序儀、LightCycler480 Software Setup。

1.4試驗方法

1.4.1DNA抽提依照土壤基因組DNA快速抽提試劑盒說明書操作。

1.4.2標準品制備

1.4.2.1普通PCRPCR反應體系25 μL：模板DNA 0.5 μL，引物F（10 μmol/L）0.5 μL，引物R（10 μmol/L）0.5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，Taq Buffer（10×）2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，H2O 18.3 μL。反應條件為：預變性95 ℃ 3 min；變性94 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，修復延伸72 ℃ 8 min，循環數35。

1.4.2.2PCR電泳2%瓊脂糖凝膠，1×TAE，150 V，100 mA，20 min電泳觀察（圖1）。

1.4.2.3PCR回收依照柱式DNA膠回收試劑盒說明操作。

1.4.2.4克隆測序連接反應10 μL：Solution 5 μL，pMD 18-T Vector 10 ng，PCR Product 5 μL，4 ℃過夜連接。連接產物轉化依照一步法快速感受態細胞制備試劑盒說明操作。質粒提取依照SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒說明操作。

1.4.2.5定量質粒信息構建好的質粒經測序鑒定無誤后用紫外分光光度計測定質粒D260 nm的值，通過公式換算成拷貝數（copies/μL）。10倍梯度稀釋構建好的各質粒，90 μL稀釋液+10 μL質粒，做4～6個點，通過預試驗選取合適標準品用于制備標準曲線。

1.4.3熒光定量PCR檢測反應體系見表1，PCR循環條件見表2。完成后，把加好樣品的96/384孔板放在LightCycler480 Software Setup（Roche）中進行反應。

2結果與分析

由表3可見，5種抗生素抗性基因sul1、sul2、txtA，txtB和txtC在屠宰場廢水原水中均有檢出，其平均絕對含量分別為5.18×105、1.48×105、6.71×105、5.77×103和9.77×105 copies/L， 5種抗生素抗性基因中sul1、sul2、txtA和txtC平均絕對含量較高，說明含有sul1、sul2、txtA和txtC基因的宿主菌較含有txtB基因的宿主菌對各種環境耐受力更強。本次屠endprint

2.1厭氧處理對5種抗生素抗性基因的絕對含量和相對豐度的影響

從厭氧池進出水中可見，水質中sul1、sul2、txtA，txtB和txtC 5種抗生素抗性基因平均絕對含量均有所下降（圖2、表3），基于水量平衡計算可得5種抗生素抗性基因平均去除率分別為43.06%、28.35%、67.64%、31.65%和43.31%。但從5種抗生素抗性基因平均相對豐度分析（圖3、表3），僅有txtA基因呈現下降趨勢，sul1、sul2、txtB和txtC基因平均相對豐度呈現上升趨勢，由此推斷厭氧處理可以通過減少微生物生物量降低抗生素抗性基因絕對含量，且對txtA基因有一定的處理效果，但厭氧處理可能對于sul1、sul2、txtB和txtC基因存在潛在的累積風險。厭氧處理過程中水力停留時間（SRT）、溫度、pH值等工藝參數是否對于抗生素抗性基因降解和吸附產生影響，以及如何改善厭氧處理工藝流程提高對于sul1、sul2、txtB和txtC的去除效率有待進一步研究。

2.2潛流人工濕地對5種抗生素抗性基因的絕對含量和相對豐度的影響

從潛流人工濕地進出水中可見，水質中sul1、sul2、txtA，txtB和txtC這5種抗生素抗性基因平均絕對含量均有所上升（圖2、表3）。從基因平均相對豐度分析，sul2和txtA基因呈現下降趨勢，txtB和txtC基因平均相對豐度沒有明顯變化，而sul1基因平均相對豐度呈現上升趨勢（圖3、表3）。上述結果說明，被測污水工程中潛流人工濕地對于sul2和txtA基因有一定去除效果，對于sul1、txtB和txtC基因沒有明顯去除能力，但由于潛流人工濕地運行引起微生物生物量增加，使得抗生素抗性基因的絕對含量呈現上升趨勢。一般研究報道認為潛流人工濕地可以有效降低抗生素抗性基因的絕對含量和相對含量[10-11]，但結論大多來源于實驗室模擬條件和工程實例中污水含抗生素抗性基因含量較高的情況，本次針對污水處理工程中潛流人工濕地對抗生素抗性基因檢測結果顯示，其處理效果并不理想，在污水處理工程中是否存在濕地使用時間及其他工藝運行參數影響潛流人工濕地對抗生素抗性基因去除效果有待進一步研究。

2.3氧化塘對5種抗生素抗性基因的絕對含量和相對豐度的影響

從氧化塘進出水中可見，水質中sul1、sul2、txtA，txtB和txtC這5種抗生素抗性基因平均絕對含量均有所下降（圖2、表3），計算可得氧化塘對于5種抗生素抗性基因平均去除率分別為77.59%、18.34%、82.05%、98.55%和96.82%。但出水中僅txtB和txtC基因平均相對豐度呈現下降趨勢，sul1、sul2和txtA這3種抗生素抗性基因平均相對豐度呈現上升趨勢（圖3、表3）。研究表明，氧化塘對于不同抗生素抗性基因相對豐度影響不一，joy等研究表明氧化塘可以有效降低ermB和ermF的豐度[12]，而Barkovskii等研究認為氧化塘處理可以降低tetB和txtL基因的相對豐度，但對tetG、tetM、tetO和txtX基因的相對豐度沒有影響甚至有所提高，究其原因可能是這些基因常位于轉移元件上，在處理過程中發生了基因的水平轉移[13]。本次檢測結果說明，氧化塘可以通過減少微生物生物量降低抗生素抗性基因絕對含量，氧化塘工藝對于txtB和txtC基因去除效果較好，而對于sul1、sul2和txtA基因可能存在累積風險。

2.4表面流人工濕地對5種抗生素抗性基因的絕對含量和相對豐度的影響

從表面流人工濕地進出水中可見，水質中sul1、sul2、txtA和txtC這4種抗生素抗性基因的平均絕對含量和平均相對豐度均呈現下降趨勢，4種抗生素抗性基因平均去除率分別為 99.23%、98.79%、97.86%和99.63%，但txtB基因的平均絕對含量和平均相對豐度均未發生明顯變化（圖2、圖3、表3）。一般認為表面流人工濕地可以通過吸附、過濾、氧化、沉淀、微生物分解、轉化、植物遮蔽等作用機理除去抗性基因[10，14]，本次檢測結果證明了上述觀點，但本次檢測結果也表明表面流人工濕地對于絕對含量相對較低的txtB基因去除效果不佳，由于txtB基因在屠宰廢水中含量不高，因此屠宰廢水處理工程實例中可以采用表面流人工濕地作為有效降低抗生素抗性基因含量的工藝流程。

3結論與討論

從本次研究結果分析，目前，浙江中法農業科技發展有限公司屠宰廢水處理工程可以有效去除大部分抗生素抗性基因，工程中不同的處理流程對于不同的抗生素抗性基因處理效果不同，厭氧處理工藝和氧化塘工藝可以通過減少微生物生物量有效地降低抗生素抗性基因的絕對含量，但可能存在某些抗生素抗性基因累積風險，而表面流人工濕地對于屠宰廢水中抗生素抗性基因的絕對含量和相對豐度有有效的處理效果。研究表明，在傳統生物污水處理工藝基礎上增加消毒工藝、高級氧化工藝等深度處理工藝可以更有效地消減抗生素抗性基因含量[15]，為此建議企業在現有基礎上增加深度處理工藝。

目前，我國對于污水中抗生素抗性基因排放并無要求，但考慮到抗生素抗性基因對人類帶來的風險，建議在經濟條件允許的條件下，企業盡量選擇對于抗生素抗性基因處理效果好的污水處理工藝，以便應對抗生素抗性基因污染。同時，國家相關部門應盡快制定養殖業中合理使用抗生素的標準并出臺抗生素及抗生素抗性基因污染治理的政策和法規，以便規范養殖業健康良性發展并改善我國現階段污染狀況。

鑒于污水工程是抗生素抗性基因轉移和傳遞的重要污染源，建議未來關于抗生素抗性基因研究重點放在：（1）抗生素抗性基因環境傳播機制；（2）污水處理過程中抗生素濃度、重金屬含量及微生物群落與抗生素抗性基因的關系；（3）污水處理工藝參數對抗生素抗性基因去除和累積的影響。

嘉興市是國家首批海綿城市建設試點城市，建議地方各級有關部門提高對抗生素抗性基因污染治理的重視程度，加大對于抗生素抗性基因治理應用性研究成果的推廣力度，以便實現海綿城市對污染物削減率目標，更好地為浙江省“五水共治”提供經驗和技術支持。endprint

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