不同提取方法對靈芝孢子油的影響

楊文婧，周 俊，龐 敏，操麗麗

靈芝是一種藥用真菌，其含有豐富的生理活性物質，包括三萜類、靈芝多糖、甾醇等。靈芝孢子是靈芝的有性生殖細胞，具有靈芝的全部遺傳活性物質。靈芝孢子油是靈芝孢子的脂質提取物，富含三萜類靈芝酸、多不飽和脂肪酸[1-2]，具有抗腫瘤[3-4]、免疫調節[5]、保護調節神經系統[6]、降血脂[7]、保肝護肝[8-9]等生理活性。因此，對靈芝孢子油的研究是靈芝研究的一個熱點。

目前，靈芝孢子油的提取主要是采取溶劑浸提法、超臨界CO2萃取法[10]等。超臨界CO2萃取法具有無化學溶劑消耗和殘留、無污染、工藝簡單、萃取物純度高等優點，但由于其設備昂貴、生產成本高、批處理量小等缺點，其在工業化上的應用也受到了一定的限制[11-12]。溶劑浸提法具有生產成本小、提取率較高、操作簡單等優點，但存在溶劑殘留的問題。水酶法具有工藝條件溫和安全、操作溫度低、能耗低、能有效地保護油脂的品質等優點，已應用于大豆油、花生油、玉米胚芽油等油脂工業中，但關于用水酶法提取靈芝孢子油鮮見報道[13-14]。試驗采用超臨界CO2萃取法、索氏抽提法、水酶法3種方法對靈芝孢子油進行提取，以靈芝孢子油的提取率為指標，對3種提取方法進行比較分析，確定靈芝孢子油的最佳提取方法，旨在為今后靈芝孢子油的工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

破壁靈芝孢子粉（破壁率≥99.9%），安徽黃山云樂靈芝有限公司提供。

齊墩果酸標準品（純度≥98%，色譜級）、中性蛋白酶（80 000 U/g），北京索萊寶科技有限公司提供；石油醚（沸程30～60℃）、無水乙醇、乙酸乙酯、香草醛、冰醋酸、無水硫酸鈉等試劑均為分析純，中國國藥集團化學試劑有限公司提供；正庚烷、甲醇，色譜純，美國Merck公司提供。

食品級CO2，純度大于99.5%。

1.2 儀器與設備

TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產品；HA121-50-01-C型超臨界CO2萃取裝置，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司產品；AL104型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產品；SER158/3型全自動索氏提取儀，意大利VELP公司產品；7890A型氣相色譜儀，安捷倫科技有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 索氏提取法提取靈芝孢子油

在50℃烘箱中烘干破壁孢子粉至恒質量，準確稱取5.0 g破壁靈芝孢子粉于濾紙筒中；在已經干燥至恒質量的抽提瓶中倒入約2/3，使其能浸沒濾紙筒，在萃取溫度60℃條件下，考查萃取時間分別為4，5，6，7 h對靈芝孢子油得率的影響；得到石油醚萃取液、減壓蒸餾后，收集油樣待測。

1.3.2 水酶法提取靈芝孢子油

在50℃烘箱中烘干破壁孢子粉至恒質量，稱取10.0 g破壁靈芝孢子粉，按1∶5（g∶mL） 的料液比加入0.025 mol/L的磷酸緩沖液（pH值6.8），使其浸泡1 h后，在100℃水浴鍋高溫滅酶10 min，取出待物料，降到酶解所需溫度50℃時，按2 000 U/g加入中性蛋白酶，分別研究酶解2，3，4，5 h對靈芝孢子油得率的影響。將酶解液以轉速5 000 r/min離心10 min后，收集上層清油并用無水Na2SO4干燥后保存用于待測[8-11]。

1.3.3 超臨界CO2萃取法提取靈芝孢子油

在50℃烘箱中烘干破壁孢子粉至恒質量，稱取50 g破壁靈芝孢子粉置于500 mL萃取釜中，CO2流量20 L/h，在預試驗的基礎上，對影響超臨界萃取效果的萃取溫度、萃取壓力、萃取時間等因素采用L9（34）正交試驗設計，以靈芝孢子油得率為指標，進行萃取工藝條件優化，所得萃取液經減壓蒸餾后，收集油樣待測。

超臨界CO2萃取工藝因素與水平設計見表1。

表1 超臨界CO2萃取工藝因素與水平設計

1.3.4 孢子油得率的計算

1.3.5 三萜類物質含量的測定

（1） 標準曲線的繪制。精密稱取 10 mg齊墩果酸，以無水乙醇為溶劑，配制成50 mL質量濃度為0.2 g/L的齊墩果酸乙醇溶液。精密吸取齊墩果酸標準液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL分別置于10 mL具塞試管中，加熱揮去溶劑，再加入0.4 mL新制的5%香草醛-冰醋酸液及1.6 mL高氯酸，在70℃恒溫水浴加熱15 min，冷卻至室溫后再加入4 mL乙酸乙酯稀釋，于波長560 nm處測定吸光度[15-16]。以吸光度為縱坐標，齊墩果酸質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。標準曲線方程為Y=4.195 7X+0.155 2，該方程的相關系數為0.999。

（2）孢子油中三萜類物質含量的測定。準確稱取一定量靈芝孢子油樣品充分溶解于乙酸乙酯中，取1.0 mL溶液于水浴上蒸干溶劑后，按上述同樣方法處理后測定吸光度，計算三萜類物質的含量。

1.3.6 靈芝孢子油脂肪酸組成的測定

（1） 脂肪酸的甲酯化。取20 mg孢子油于圓底燒瓶中，加入2 mL 0.5 mol/L甲醇鈉溶液，加熱回流20 min后，再加入2 mL 0.5 mol/L的硫酸甲醇溶液，煮沸10 min。取出燒瓶，冷卻后，用2 mL正庚烷萃取2次，合并萃取液，用無水Na2SO4干燥2次，過濾備用進行GC分析[17-18]。

（2） 靈芝孢子油脂肪酸組成分析。GC條件為DB-WAX型毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；程序升溫：100℃保持1 min，以20℃/min升溫至200℃，再以3℃/min升溫至230℃，保持12 min；進樣口溫度230℃，FID溫度250℃，分流比1∶50，進樣量1μL；載氣：N2，載氣流速0.8 mL/min。

脂肪酸組成采用面積歸一法進行計算。

2 結果與分析

2.1 靈芝孢子油的提取

2.1.1 索氏抽提法

不同提取時間對孢子油提取率的影響見表2。

由表2可知，隨著提取時間的增加，提取率先呈增加的趨勢，當提取時間達到6 h以后，提取率基本不再增加，隨著孢子油提取率增加，孢子油中三萜化合物的含量也在不斷增加。這可能是由于隨著提取時間的增加，有機溶劑與靈芝孢子接觸越充分，抽提效果也就越充分，當提取時間達到6 h以后，靈芝孢子中脂類物質基本上都被抽提出來，孢子油提取率基本不再增加了。

表2 不同提取時間對孢子油提取率的影響

2.1.2 水酶法

不同酶解時間對提取效果的影響見表3。

表3 不同酶解時間對提取效果的影響

由表3可知，隨著酶解時間的增加，提取率沒有太大的變化，提取率都較低，這可能是由于水酶法中油與蛋白質、多糖等形成了穩定的乳化液，嚴重影響了提油率。但提取的孢子油中的三萜化合物的含量在不斷提高，酶解5 h時提取的孢子油中三萜化合物含量達到28.96%，這可能是由于三萜化合物結構中存在親水的羥基基團，相較于靈芝孢子油易于溶入乳化液中。

2.1.3 超臨界CO2萃取法

正交試驗結果與分析見表4。

表4 正交試驗結果與分析

從表4中極差分析結果可以看出，3個因素對靈芝孢子油提取率的影響大小依次為萃取壓力（B）＞萃取時間（C） ＞萃取溫度（A）。在試驗設計范圍內，優化得到超臨界CO2萃取靈芝孢子油的最佳條件為A2B2C2，即萃取壓力30 MPa，萃取溫度45℃，萃取時間3 h，CO2流量20 L/h，該組合沒有在正交試驗的9個組合中出現，驗證試驗結果表明，在此條件下靈芝孢子油的提取率為24.63%，孢子油中三萜化合物的含量為25.15%。

2.2 孢子油中脂肪酸組成分析

靈芝孢子油的脂肪酸GC圖譜見圖1，靈芝孢子油主要脂肪酸組成見表5。

圖1 靈芝孢子油的脂肪酸GC圖譜

表5 靈芝孢子油主要脂肪酸組成

由圖1和表5可知，3種提取方法得到的靈芝孢子油中脂肪酸種類沒有差異，主要由軟脂酸、軟脂油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等脂肪酸組成，并且各種脂肪酸含量也不存在顯著差異。靈芝孢子油中不飽和脂肪酸含量高，可達80%以上，其中油酸的含量超過60%，并富含亞油酸，使靈芝孢子油具有降低血脂、降血壓、軟化血管等生理活性。

3 結論

比較了索氏抽提法、水酶法、超臨界CO2萃取法對靈芝孢子油提取效果的影響，結果表明水酶法的提取率最低，但其孢子油中含有的三萜類物質含量最高。索氏提取法提油率最高，三萜類物質含量卻是最低的，3種提取方法提取的孢子油脂肪酸組成和含量沒有顯著影響，且靈芝孢子油中富含油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸。通過正交試驗優化得到超臨界CO2萃取靈芝孢子油的最佳條件為萃取壓力30 MPa，萃取溫度45℃，萃取時間3 h，CO2流量20 L/h，在此條件下靈芝孢子油的得率為24.63%，其中三萜類化合物的含量為25.12%。

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