一株粗糙脈胞菌的鑒定及產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵工藝優(yōu)化

張玲秀，白建華，郝瑞林，董社琴

（忻州師范學院生物系，山西忻州034000）

秸稈纖維素可再生、易獲得，其相對于木質(zhì)材料木質(zhì)素含量低，對其工業(yè)利用中酶需求量和花費也較低，所以玉米秸桿作為一種優(yōu)質(zhì)生物能源材料，更具有商業(yè)利用價值（Banerjee等，2008）。

通過微生物產(chǎn)酶降解秸桿纖維素具有條件溫和，無污染等優(yōu)點，因此分離和篩選出針對不同行業(yè)的高效纖維素分解菌群，有望解決纖維素酶產(chǎn)量和活性不高，而成本偏高的問題 （張傳富等，2007）。 粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）是木質(zhì)纖維素天然降解真菌，具有良好的遺傳操作手段和功能基因組工具，在纖維素降解、糖轉(zhuǎn)運及全糖利用、纖維素酶表達分泌的分子基礎等方面取得了顯著進展（Jonathan 等，2010；Tian 等，2009）。 李建波等（2004）對粗糙脈孢菌乙醇發(fā)酵、黑色素分泌、木糖發(fā)酵等做了較為系統(tǒng)的研究。馮炘等（2005）通過優(yōu)化設計確定了Neurospora crassa 1602菌株搖瓶發(fā)酵的最佳產(chǎn)酶單因素產(chǎn)酶條件。顧芮萌等（2012）以粗糙脈孢菌基因組測序菌株fgsc2489為對象，利用相應面法，對粗糙脈孢菌纖維素酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化。

目前，對粗糙脈胞菌產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵培養(yǎng)條件工藝研究鮮有報道。本文以從忻州農(nóng)田玉米秸桿中篩選的一株粗糙脈孢菌為對象，以玉米秸桿粉為碳源，首先進行單因素優(yōu)化，進一步利用響應面法，對粗糙脈孢菌纖維素酶液體發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。旨在提高產(chǎn)纖維素酶量，為其進一步開發(fā)利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），自然pH。產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基/L：玉米秸桿粉2%， 蛋白胨 5.0 g，NaCl 0.5 g，KH2PO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g， 酵母粉 1 g，pH 自然。1.2 方法

1.2.1 菌種的鑒定 菌種的形態(tài)學分類鑒定參見魏景超（1979）方法。

真菌18SrDNA擴增鑒定：采用CTAB法提取總 DNA，PCR 擴增引物為 ITS1：5'TCCG TAGG TGAA CCTG CGG3'和 ITS4：5'TCCT CCGC TTAT TGATATGC3'。PCR反應條件為94℃預變性4min，然后進入循環(huán)，94℃變性1 min，55℃退火40 s，72℃延伸 90 s，共 35個循環(huán)，最后 72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，Image Lab 3.0軟件分析。

1.2.2 CMC-Na酶活力測定 纖維素酶活力的定義（IU/mL）：指 1 min 催化底物生成 1 μmol葡萄糖所需要的酶量。

Y=（D·n·1000）/T·V·M；

式中：D為生成的葡萄糖含量；由標準曲線得知，n為稀釋倍數(shù)；T為反應時間，30 min；V為酶液體積，1 mL；M為葡萄糖的質(zhì)量分數(shù)，180。

取兩支試管（試驗組和對照組），各加入2 mL 1%CMC-Na溶液，試驗組加 0.5 mL稀釋酶液，空白對照不加，混勻后置于50℃水浴，反應30 min，兩試管都加入DNS試劑3 mL，空白管加入100℃煮沸10 min后失活的酶液0.5 mL，搖勻后將兩管放入沸水浴加熱10 min，取出迅速冷卻到室溫，空白管調(diào)零，在540 nm下測試驗組吸光值，通過葡萄糖標準曲線計算還原性糖含量。

1.2.3 單因素及響應面法優(yōu)化設計 單因素優(yōu)化選取4個因素:培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、初始pH，以CMC-Na酶活力為指標，得到各因素最適水平，然后根據(jù)Box-Behnken設計原理，設計響應曲面分析試驗，其因素水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼

2 結(jié)果

2.1 rDNA-ITS序列測序與比對結(jié)果分析 基因擴增產(chǎn)物純化后由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，菌種與從GENBANK獲取的相似序列經(jīng)DNAMAN軟件進行比對分析并構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1。

圖1 粗糙脈孢菌QF的rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶量的影響 將活化菌種接入培養(yǎng)瓶中，28℃連續(xù)培養(yǎng)7 d，每隔24 h檢測一次酶產(chǎn)量，繪制產(chǎn)酶曲線。結(jié)果見圖2，第5天產(chǎn)酶量最多，因而后續(xù)研究選擇產(chǎn)酶最高的第5天進行分析。

圖2 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響

2.3 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶量的影響 分別選取不同溫度:22、25、28、31、34 ℃，連續(xù)培養(yǎng) 5 d 后，測定其酶活，結(jié)果見圖3，發(fā)酵溫度與產(chǎn)酶量有一定的關系，溫度過高或者過低都會影響酶的合成和分泌，其中，28℃條件下，產(chǎn)酶最高，為7.4 IU/mL。

圖3 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響

2.4 搖瓶轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶量的影響 在不同搖床轉(zhuǎn)速下（50、100、150、200、250 r/min）培養(yǎng) 5 d，測定其發(fā)酵液酶活，結(jié)果見圖4。

圖4 搖瓶轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響

2.5 初始pH對產(chǎn)酶量的影響 不同初始pH培養(yǎng)基（1、3、5、7、9）對產(chǎn)酶量的影響如圖 5 所示。

圖5 初始pH對產(chǎn)酶的影響

2.6 響應曲面試驗結(jié)果

2.6.1 Box-Behnken設計試驗結(jié)果 以初始pH（X1）、轉(zhuǎn)速（X2）、溫度（X3）為自變量，以產(chǎn)纖維素酶量為響應指標，采用 Box-Behnken方法設計響應面分析試驗，試驗設計及試驗結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗設計及結(jié)果

2.6.2 響應面設計結(jié)果 根據(jù)表2的試驗結(jié)果，利用Design Expert v8.0.5.b軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，所得主要分析結(jié)果見表3。

二次模型中回歸系數(shù)的顯著性檢驗表明：因素A對產(chǎn)酶量影響效果的線性效應顯著，因素B和C效應不顯著；因素A2、B2、C2對結(jié)果的曲面效應顯著，因素交互影響均不顯著。對試驗數(shù)據(jù)進行多次擬合回歸，以纖維素酶量（Y）為因變量，初始pH（A）、轉(zhuǎn)速（B）、溫度（C）為自變量建立回歸方程模型為：

表3 回歸與方差分析結(jié)果

Y=+12.31+1.29A+0.88B+0.72C+0.41AB-0.068AC-0.022BC-2.23A2-3.47B2-1.89C2。

另外，由表3可知，試驗因素對產(chǎn)酶量影響顯著程度由大到小依次為初始pH＞轉(zhuǎn)速＞溫度；模型的回歸F值為11.91，P=0.0018（P＜0.05為模型顯著），表明該模型極顯著；多元相關系數(shù)R2=0.9387，調(diào)整R2=0.9399，表明模型對試驗實際情況擬合較好，失擬項差異不顯著 （P=0.2277＞0.05），表示該方程試驗擬合效果較好。

2.6.3 響應面圖及等高線圖 響應面和等高線結(jié)果見圖6～8。在響應曲面圖中，單因素影響效果與曲面陡峭相關，曲面越陡峭，影響越顯著。等高線圖與響應面圖相對應，響應值越大曲線越接近中心。各因素交互作用與等高線形狀相關，圓形則為不顯著，橢圓為顯著。

通過 Design Expert（v8.0.5.b）軟件分析，粗糙脈孢菌產(chǎn)酶量的最佳培養(yǎng)條件為初始pH 7、轉(zhuǎn)速159.24 r/min、培養(yǎng)溫度27.9℃，此條件下菌體生物量的理論值為17.67 IU/mL。在該條件下進行3次試驗驗證，產(chǎn)酶量平均值為17.1 IU/mL，與預測值的誤差僅為3.23%，表明該模型可靠性高，應用響應曲面法優(yōu)化粗糙脈孢菌產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件是可行的。

圖6 初始pH與轉(zhuǎn)速及其交互作用對產(chǎn)酶量影響的響應面和等高線圖

圖7 轉(zhuǎn)速與溫度及其交互作用對產(chǎn)酶量影響的響應面和等高線圖

圖8 初始pH與溫度及其交互作用對產(chǎn)酶量影響的響應面和等高線圖

3 討論

農(nóng)業(yè)廢棄物主要包括農(nóng)作物秸稈、畜禽糞便等，其主要組成成分是纖維素類物質(zhì)。化工領域利用纖維素主要用高溫、高壓、強酸等方法處理，不僅成本高，而且污染環(huán)境（楊林麗等，2013）。

纖維素酶降解方法的優(yōu)點是能源消耗低，是專一性很強的催化劑，但酶分子體積龐大，很難越過半纖維素和木質(zhì)素的障礙，與纖維素緊密結(jié)合，所以進行該方法的反應時間長，且需在加熱過程中進行振蕩加熱，使反應充分，一般要培養(yǎng)5～7 d，在培養(yǎng)菌絲的過程中容易有雜菌生長，需進行雜菌的處理。另外應用纖維素酶法處理秸稈纖維素條件溫和，但酶活力一直達不到應用于實踐的水平，而且價格昂貴。所以開發(fā)高產(chǎn)纖維素酶的菌種，利用酶固定化催化法是可行的辦法（Rizzatti等，2001）。

響應面法是一項綜合數(shù)學和統(tǒng)計學方法的優(yōu)化技術。此方法可以對影響相關響應值的多個因素進行建模和分析，評估多個因素與響應值之間的關系，得到最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基條件（Jatinder等，2006）。

響應面分析法在粗糙脈孢菌產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化中取得了較為良好的效果，利用粗糙脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)酶的研究還處在初期階段，要實現(xiàn)其產(chǎn)酶潛力，還需要大量的研究，特別是針對深層液體發(fā)酵條件的菌株遺傳改造工作和適合粗糙脈孢菌液體發(fā)酵條件優(yōu)化值得深入研究（顧芮萌等，2012）。

4 結(jié)論

本試驗以忻州地區(qū)腐敗玉米秸桿、牛羊等食草動物糞便為原料，從中篩選出一株降解纖維素菌種，并確定其為粗糙脈孢菌（Neurosporacrassa）。通過對其液體發(fā)酵產(chǎn)纖維酶工藝進行優(yōu)化，在最佳培養(yǎng)條件初始pH 7、轉(zhuǎn)速159.24 r/min、培養(yǎng)溫度27.9℃下，經(jīng)試驗驗證，產(chǎn)酶量為17.1 IU/mL，提高了39.1%。

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