響應(yīng)面分析靈芝菌糠發(fā)酵飼料加工調(diào)制與優(yōu)化研究

劉 月， 李志濤， 李杰峰*， 趙志強(qiáng)， 劉軍峰， 林冬梅

（1.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北保定 071000；2.江南大學(xué)，江蘇無錫 214122；3.河北工程大學(xué)，河北邯鄲 056001）

菌糠的主要成分是棉籽皮、農(nóng)作物秸稈、玉米芯、鋸木屑及殘余菌絲體。目前，菌糠的處理方式大多數(shù)為焚燒或隨意丟棄，少數(shù)用于食用菌栽培的二次培養(yǎng)料或開發(fā)成肥料，極少部分開發(fā)用作動(dòng)物的飼料補(bǔ)充料。研究表明，菌糠中含有大量的粗蛋白質(zhì)和豐富的糖類、有機(jī)酸類及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，另外，菌糠中還含有大量的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等抗?fàn)I養(yǎng)因子，這些成分難以被畜禽直接消化利用（潘軍，2010）。羅茂春等（2014）利用乳酸菌酵母菌制作白玉菇菌糠發(fā)酵飼料，菌糠發(fā)酵飼料的營(yíng)養(yǎng)和感官品質(zhì)均得到較大改善；通過進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定了最佳工藝條件為白玉菇菌糠：玉米粉 8∶1、發(fā)酵溫度 30 ℃、乳酸菌:酵母菌 1∶2、菌液接種量2.5%，在此條件下白玉菇菌糠粗蛋白質(zhì)含量為14.82%。張麗美等（2013）在菌糠中接入枯草芽孢桿菌對(duì)其發(fā)酵后，枯草芽孢桿菌的芽孢數(shù)為8×109cfu/g干重。靈芝收菇后的菌糠污染率小、獲得率高，而且僅收一潮菇，菌糠中養(yǎng)分剩余率高、具有較豐富的碳源與氮源等特點(diǎn)。因此，本試驗(yàn)選取靈芝菌糠作為研究對(duì)象，將靈芝菌糠與玉米粉混合搭配，接入假絲酵母菌和嗜酸乳桿菌混合菌液，進(jìn)行厭氧發(fā)酵。通過Plackett－Burman與中心復(fù)合試驗(yàn)優(yōu)化其發(fā)酵條件，為菌糠的合理開發(fā)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 靈芝菌糠：邯鄲市榮珍食用菌合作社提供。

菌種：高活性干酵母粉由安琪酵母股份有限公司提供，粉末固體，活菌量＞4×109cfu/g。嗜酸乳桿菌粉由常州生物科技有限公司提供，粉末狀固體，活菌量＞4×109cfu/g。

發(fā)酵袋：具有單向排氣閥裝置，規(guī)格30 cm×20 cm，袋裝容量1000 g。

1.2 靈芝菌糠營(yíng)養(yǎng)成分分析 收集無污染、無霉變的靈芝菌糠進(jìn)行粗蛋白質(zhì)、粗纖維、粗脂肪、無氮浸出物、鈣、磷和灰分測(cè)定。測(cè)定方法依據(jù)國(guó)標(biāo)和飼料分析檢測(cè)常規(guī)方法進(jìn)行。

1.3 靈芝菌糠發(fā)酵飼料制備

1.3.1 菌糠預(yù)處理 將選取的靈芝于65℃烘干、粉碎后過60目篩孔篩選，按比例加入玉米粉充分混合，將其作為發(fā)酵原料，121℃高壓滅菌30 min后，裝入發(fā)酵袋中待用。

1.3.2 菌液制備 假絲酵母菌液制備方法：配質(zhì)量濃度為5 g/L葡萄糖活化溶液，調(diào)溫至35℃，將高活性干酵母粉按照質(zhì)量比溶解于活化液中，在33～35℃下活化1 h，得到假絲酵母菌液。

嗜酸乳桿菌液制備方法：配質(zhì)量濃度為5 g/L葡萄糖活化溶液，調(diào)溫至40℃，將嗜酸乳桿菌粉按照質(zhì)量比溶解于活化液中，在37～40℃下活化30 min，得到嗜酸乳桿菌液。

混合菌液制備：將假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液按照質(zhì)量比混合均勻，得到混合菌液。

1.3.3 發(fā)酵 在發(fā)酵袋中按比例接入混合菌液，并按比例補(bǔ)充水分，調(diào)節(jié)pH，密封后在設(shè)定溫度下發(fā)酵，按時(shí)取樣測(cè)定，檢驗(yàn)發(fā)酵效果。

1.4 方法

1.4.1 Plackett-Burman試驗(yàn)關(guān)鍵因子篩選 采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法對(duì)影響靈芝菌糠發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量的9個(gè)影響因素進(jìn)行篩選，選用試驗(yàn)次數(shù)N＝12的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，其9個(gè)影響因素分別為：靈芝菌糠和玉米粉質(zhì)量比（X1）、假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液質(zhì)量比（X2）、菌液接種量（X3）、發(fā)酵袋裝量（X4）、料水比（X5）、初始 pH（X6）、發(fā)酵溫度（X7）、發(fā)酵濕度（X8）和發(fā)酵時(shí)間（X9），響應(yīng)值為靈芝菌糠發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量。各因素及其代碼、編碼水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及代碼水平

1.4.2 最陡爬坡試驗(yàn) 響應(yīng)面擬合方程只有在接近最佳值區(qū)域才近似真實(shí)情況，因此要先逼近此區(qū)域才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程，通常用最陡爬坡法快速的逼近最佳值區(qū)域。最陡爬坡法以Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，爬坡路徑與主要因素的效應(yīng)一致（張曉萍，2010）。

1.4.3 發(fā)酵條件的中心組合優(yōu)化 采用響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)（Box-Behnken design），對(duì)靈芝菌糠發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量的顯著影響因子進(jìn)一步優(yōu)化，根據(jù)Plackett-Burman和最陡爬坡法試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合因素的效應(yīng)大小和試驗(yàn)中的實(shí)際情況，選擇下一步試驗(yàn)水平的中心點(diǎn)和各水平的步長(zhǎng)（夏海濤，2014； 李 立 英 ，2012； 王 普 ，2006；Kalil，2000；Davies，1967），響應(yīng)值為靈芝菌糠粗蛋白質(zhì)含量，各因子和代碼水平見表2。

表2 Box-Behnken design試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及代碼水平

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)關(guān)鍵因子篩選 運(yùn)用SAS軟件對(duì)Plackett-Burman設(shè)計(jì)進(jìn)行分析，由試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果（表3）及各因素水平和結(jié)果（表4）得知，模型 Pr＞F=0.048538＜0.05，表明響應(yīng)面回歸模型為顯著水平，模型的校正系數(shù)R2＝0.9890，說明該模型方程擬合程度良好。模型的修正系數(shù)R2Adj=0.9395，表明該模型較好地反映了各因素之間的關(guān)系。各因素對(duì)靈芝菌糠粗蛋白質(zhì)含量的影響大小依次為：X5、X6、X3、X2、X4、X9、X1、X8、X7（按回歸系數(shù)絕對(duì)值大小排序），其中 X2、X3、X5、X6為顯著水平，X1、X2、X3、X7、X8呈正效應(yīng)， 而 X4、X5、X6、X9呈負(fù)效應(yīng)。因此確定 X2、X3、X5、X6為 4 個(gè)主要因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)回歸方程為：

Y=17.03899+0.451667X2+0.175X3-0.634667X5-0.788889X6。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)Plackett-Bueman試驗(yàn)篩選出的4個(gè)主要因素回歸系數(shù)效應(yīng)值的正負(fù)大小，設(shè)計(jì)爬坡方向和步長(zhǎng)進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)以逼近最大區(qū)域。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表5所示，由表5可知，靈芝菌糠粗蛋白質(zhì)含量在試驗(yàn)5附近，故以第5組試驗(yàn)條件為水平中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2.3 發(fā)酵條件中心組合優(yōu)化 在最陡爬坡試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取X2、X3、X5、X6進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析方法，以靈芝菌糠粗蛋白質(zhì)含量為響應(yīng)值，結(jié)果見表6。

采用SAS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，由此可求出影響因素的一次效應(yīng)、二次效應(yīng)及其交互效應(yīng)的關(guān)聯(lián)式，得到回歸方程式：

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 Plackett-Bueman設(shè)計(jì)回歸方程系數(shù)及其顯著性檢驗(yàn)

表5 爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Y=-365.087+26.71917X2+23.1125X3+19.37X5+74.25X6-1.873333X2X2+0.64X2X3-1.08X2X6-1.584583X3X3-1.145X3X6-0.046383X5X5-5.753333X6X6。

對(duì)該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表7所示，由此可知模型Pr>F=0.0001，表明響應(yīng)面回歸模型達(dá)到了極顯著水平，模型的校正系數(shù)R=0.9566，說明該方程擬合程度良好。模型的修正系數(shù)R2Adj=0.9059，表明該模型較好地反映了各因素之間的關(guān)系。通過對(duì)回歸方程的方差分析得出，一次項(xiàng) X2、X3、X5、X6，二次項(xiàng) X22、X32、X52、X62和交互項(xiàng)X2X3、X2X6、X3X6對(duì)靈芝菌糠粗蛋白質(zhì)含量的影響是顯著的，各試驗(yàn)因子對(duì)靈芝菌糠粗蛋白質(zhì)含量的影響為非線性關(guān)系。

表6 Box-Behnken design試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)上述回歸方程和回歸模型方差分析繪出響應(yīng)曲面，見圖1。兩因素之間的影響呈拋物線型關(guān)系，且均有一個(gè)極大值點(diǎn)，變化趨勢(shì)先增大后減小。通過求解回歸方程得到靈芝菌糠發(fā)酵飼料的最佳工藝是：假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液用量比6.781108∶1、菌液接種量6.774657%、料水比1.139045∶1和初始 pH 5.159828，靈芝菌糠粗蛋白質(zhì)含量的預(yù)測(cè)值為14.883813%。考慮到實(shí)際操作，將試驗(yàn)的條件修改為假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液用量比6.8∶1、菌液接種量6.8%、料水比1.1∶1 和初始 pH 5.2。

表7 回歸模型方差分析

2.4 優(yōu)化條件下靈芝菌糠發(fā)酵飼料驗(yàn)證結(jié)果在最佳組合條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，測(cè)定實(shí)際靈芝菌糠粗蛋白質(zhì)含量為14.51%，與預(yù)測(cè)值14.88%基本吻合，偏差較小，說明得到的回歸模型和實(shí)際情況擬合較好，進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的可行性具有實(shí)用價(jià)值。靈芝菌糠發(fā)酵前與發(fā)酵后營(yíng)養(yǎng)含量和感官品質(zhì)對(duì)比如表8所示。

3 討論

本文通過以靈芝菌糠為發(fā)酵原料，接入混合菌種進(jìn)行厭氧發(fā)酵，研究其制作發(fā)酵飼料的工藝條件。通過響應(yīng)面分析法中Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響靈芝菌糠發(fā)酵效果的諸多相關(guān)因素進(jìn)行分析并成功篩選出主效應(yīng)因子，在Plackett-Burman設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上，根據(jù)主效應(yīng)因子作用大小與方向進(jìn)行爬坡試驗(yàn)，得到以假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液用量比6∶1、菌液接種量6%、料水比1∶1和初始pH 5為水平中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。通過Box-Behnken design中心復(fù)合試驗(yàn)，對(duì)主效應(yīng)因子進(jìn)一步優(yōu)化。得到假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液用量比、菌液接種量、料水比和初始pH對(duì)靈芝菌糠中粗蛋白質(zhì)含量影響的最佳值。

經(jīng)對(duì)靈芝菌糠發(fā)酵得到的熟料干燥后制成飼料顆粒成品進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分分析，結(jié)果表明，除灰分幾乎無變化外，其粗纖維由40.11%下降到29.85%，粗蛋白質(zhì)由8.75%升高至14.51%，無氮侵出物由22.19%升高至25.92%。由此表明，靈芝菌糠經(jīng)微生物發(fā)酵后，粗纖維可轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)和單糖等無氮侵出物。因此，菌糠中粗蛋白質(zhì)、無氮侵出物顯著提高。

圖1 試驗(yàn)因子交互作用對(duì)粗蛋白質(zhì)含量的影響

利用菌糠制作發(fā)酵飼料，因選擇的菌種組合、接種量和發(fā)酵條件等的不同，生產(chǎn)的發(fā)酵飼料營(yíng)養(yǎng)成分差異較大。飼料加工、貯存和動(dòng)物種類以及飼養(yǎng)條件等因素也存在差異，菌糠發(fā)酵飼料的實(shí)際應(yīng)用效果差異也會(huì)很大。因此，篩選繁殖、抗雜菌能力強(qiáng)并對(duì)粗纖維有強(qiáng)大分解能力的菌種對(duì)不同菌糠發(fā)酵，研究其有效成分，并對(duì)菌糠發(fā)酵飼料適用動(dòng)物種類以及添加量進(jìn)行深入研究。

表8 靈芝菌糠發(fā)酵前后的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值表（烘干后測(cè)定）

4 結(jié)論

靈芝菌糠制作發(fā)酵飼料最佳制備工藝條件為假絲酵母菌液和嗜酸乳桿菌液用量比6.8∶1、菌液接種量6.8%、料水比1.1∶1和初始pH 5.2。在此條件下測(cè)得菌糠發(fā)酵飼料中粗蛋白質(zhì)含量為14.51%，與理論預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差僅為0.37%，說明模型能較好地預(yù)測(cè)靈芝菌糠發(fā)酵飼料粗蛋白質(zhì)含量的實(shí)際情況，具有較好的生產(chǎn)指導(dǎo)意義。

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