肝細胞生長因子誘導非小細胞肺癌耐藥研究

劉丹丹 王莉彥 許爾屹 趙偉華

在肺癌患者中非小細胞肺癌約占85%～90%的比重[1]，因其具有較高發(fā)病率并具有較高生命風險，促使有關臨床研究不斷增多[2-3]。吉非替尼是非小細胞肺癌化療的常見分子靶向藥物，但其僅對部分患者能夠發(fā)揮良好效用，臨床應用時常出現(xiàn)耐藥性等表現(xiàn)[4]。本研究分析肝細胞生長因子誘導敏感非小細胞肺癌細胞對吉非替尼的耐藥情況，分別選擇PC-9與H292敏感非小細胞肺癌作為試驗對象，觀察細胞增殖、凋亡、細胞周期對吉非替尼耐藥情況，預期能夠明確肝細胞生長因子誘導對腫瘤耐藥的影響，從而有效改善化療實施效果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用上海慧穎生物科技有限公司提供的PC-9人肺癌細胞與H292人肺癌細胞，上海博升生物科技有限公司提供的肝細胞生長因子，英國AstraZeneca UK Limited生產的吉非替尼片（產品批號為：LX767），福州邁新生物科技有限公司提供的鼠抗人p-EGFR、c-MET與p-MET試劑盒。

1.2 方法

提取2種不同類型非小細胞肺癌細胞分別經過PBS洗滌，再將其置入含10 ml胎牛血清的培養(yǎng)基中，以37℃、5%CO2環(huán)境下孵育，每隔72 h對其進行換液傳代。將10 μg肝細胞生長因子稀釋至濃度為100 μg/ml的待檢液，采用DMSO溶液對吉非替尼藥物進行稀釋處理，其濃度控制為50 μmol/ml。首先，開展細胞活性與藥物半數(shù)抑制濃度的檢驗，精稱100 ml細胞混懸液進行接種，再滴入肝細胞生長因子母液100 μl與吉非替尼母液100 μl，培養(yǎng)3 d時分別在各孔中滴入蒙脫土（MTT） 20 μl，持續(xù)孵育4 h后行離心處理再滴入二甲基亞砜（DMSO） 200 μl使其充分混合、溶解。應用酶標儀測定其吸光度，并計算細胞存活率。提取肺癌細胞接種6孔板中，行2次PBS清洗后再滴入肝細胞生長因子母液與吉非替尼母液，持續(xù)培養(yǎng)2 d。收集培養(yǎng)液行離心處理再進行2次PBS洗滌，給予固定120 min后行2次PBS洗滌，滴入標記液500 μl，孵育30 min，再應用流式細胞儀開展細胞周期測定。采用相同方式處理肝細胞溶液，加入肝細胞生長因子母液與吉非替尼母液并行培養(yǎng)、離心、洗滌后再滴入Binging Buffer懸浮細胞500 μl與Annexin V-PE 5 μl，室溫放置5 min后以流式細胞儀進行細胞凋亡測定。提取對數(shù)生長細胞進行裂解處理，離心處理后采集蛋白裂解液，采取BCA蛋白定量法，并應用Western blot法進行細胞蛋白測定。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據處理應用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件，半數(shù)抑制濃度等計量資料采用（±s）表示，以t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞活性與吉非替尼半數(shù)抑制濃度測定結果

PC-9細胞接受吉非替尼處理的半數(shù)抑制濃度為（0.05±0.02）μmol/L，H292細胞接受吉非替尼處理的半數(shù)抑制濃度為（0.18±0.04）μmol/L，組間比較差異具有統(tǒng)計學意義（t=5.18，P＜0.05）。吉非替尼濃度為0.01、0.04、0.1、0.4與1 μmol/L時，PC-9細胞存活率分別為80%、51%、42%、40%、39%，H292細胞存活率分別為84%、65%、50%、44%、42%，通過提高藥物濃度后細胞存活率不斷降低，表明兩種細胞接受藥物處理后的生長抑制效果與藥物濃度呈負相關性。同時，兩種細胞接受肝細胞生長因子與吉非替尼處理后其半數(shù)抑制濃度有所上升。

2.2 肝細胞生長因子誘導對吉非替尼耐藥的測定結果

PC-9細胞對照標本存活率為100%，單用吉非替尼處理后其細胞存活率為52%，采用肝細胞生長因子誘導與吉非替尼處理后其細胞存活率為61%；H292細胞對照標本存活率為100%，單用吉非替尼處理后其細胞存活率為51%，采用肝細胞生長因子誘導與吉非替尼處理后其細胞存活率為72%，表明肝細胞生長因子在兩種細胞對吉非替尼耐藥方面有誘導作用。

2.3 肝細胞生長因子誘導對細胞凋亡與細胞周期的影響

單純應用吉非替尼處理后H292細胞未見明顯細胞凋亡，處理前細胞凋亡率為8.4%，處理后細胞凋亡率為8.1%；PC-9細胞凋亡有促進表現(xiàn)，處理前細胞凋亡率為13.2%，處理后凋亡率為16.7%；觀察PC-9細胞接受肝細胞生長因子誘導與吉非替尼處理后其凋亡率有所降低，處理后凋亡率為8.3%。經肝細胞生長因子誘導對PC-9細胞與H292細胞周期無明顯影響。

2.4 細胞蛋白測定結果

Western Blot檢驗表示肝細胞生長因子對兩種肺癌細胞c-MET磷酸化均有刺激作用。肝細胞生長因子誘導前H292細 胞 c-MET表 達 為（0.122±0.013）， 磷 酸 化 c-MET表達為（0.135±0.024）；誘導后H292細胞c-MET表達為（0.147±0.019），磷酸化c-MET表達為（0.203±0.029），誘導前后H292細胞c-MET表達比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但誘導前后磷酸化c-MET表達比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。肝細胞生長因子誘導前PC-9細胞c-MET表達為（0.142±0.021），磷酸化c-MET表達為（0.165±0.029）；誘導后PC-9細胞c-MET表達為（0.146±0.031），磷酸化c-MET表達為（0.219±0.018），誘導前后PC-9細胞c-MET表達比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但誘導前后磷酸化c-MET表達比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。研究結果表現(xiàn)經肝細胞生長因子誘導后兩種細胞的磷酸化c-MET表達明顯提高。

3 討論

目前，國內臨床已將吉非替尼作為非小細胞肺癌的常用化療藥物[5-6]，但部分患者存在耐藥情況[7]，而臨床對其形成機制尚不明確[8]。肝細胞生長因子是當前腫瘤學科研究熱點內容[9]，報道表示癌癥患者通常存在肝細胞生長因子表達上升表現(xiàn)[10]，并同其侵襲情況具有緊密關聯(lián)[11-12]。本次研究分別選取了兩種吉非替尼敏感的肺癌細胞，PC-9與H292細胞均排除了其藥物耐藥影響因素。試驗結果表現(xiàn)兩種細胞接受吉非替尼處理的半數(shù)抑制度分別為（0.05±0.02）μmol/L與（0.18±0.04）μmol/L，在增加用藥濃度后兩種細胞存活率均出現(xiàn)明顯下降表現(xiàn)，體現(xiàn)其藥物濃度越高細胞生長抑制作用越強，并且應用肝細胞生長因子誘導后兩種細胞半數(shù)抑制濃度均明顯升高。同時，應用肝細胞生長因子誘導后兩種細胞存活率均有所下降，提示肝細胞生長因子在兩種細胞對吉非替尼耐藥方面有誘導作用。但肝細胞生長因子僅對PC-9細胞凋亡有所影響，對H292細胞凋亡及兩種細胞周期均無顯著影響。而Western Blot檢驗表示肝細胞生長因子對兩種肺癌細胞c-MET磷酸化均有刺激作用，在肝細胞生長因子誘導后，H292與PC-9細胞的c-MET表達未發(fā)生顯著改變，但誘導后兩種細胞的磷酸化c-MET表達分別為（0.203±0.029）與（0.219±0.018），同誘導前相比較均明顯升高，進而可推斷其耐藥作用機制或為刺激細胞c-MET磷酸化表達增強。