實驗室檢測方法在豬病防治中的應用概述

鄭樂迎，黃東波，陳生明，劉北華

（深圳市寶安區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東 深圳 518101）

養(yǎng)豬行業(yè)目前飽受多種傳染病困擾，且許多疾病都有免疫抑制作用，如豬瘟、藍耳病、圓環(huán)病、支原體等。這類傳染病一旦在豬群中定植并流傳開來，危害巨大。倪嬌等[1]2010～2011年調(diào)查了幾種病毒性傳染病的流行情況，研究顯示：國內(nèi)圓環(huán)病毒的豬場陽性率已達89.69%(87/97)，豬瘟、藍耳等病的檢出率也居高不下。對于這些疾病的監(jiān)控刻不容緩。另一方面，我們的養(yǎng)豬業(yè)中還存在部分藥物濫用問題，許多臨床獸醫(yī)根據(jù)經(jīng)驗隨意用藥，隨意增減劑量，造成細菌耐藥性和藥物殘留問題日益嚴重。不過，目前已有越來越多的規(guī)?；B(yǎng)殖場建立了自己的實驗室檢測系統(tǒng)，檢測豬群抗體水平，監(jiān)控豬群中疾病的流行情況，以彌補臨床診斷的不足。

1 抗體檢測

抗體檢測對疫苗免疫效果評價、免疫程序制定、流行狀態(tài)監(jiān)測均具有重要意義。目前比較成熟的抗體檢測技術包括：血凝試驗、中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、膠體金技術等。抗體檢測能夠幫助我們準確掌握仔豬的母源抗體水平和疫苗免疫后的抗體水平，以選擇合適的首免日齡，及時發(fā)現(xiàn)免疫失敗現(xiàn)象，評價抗體均一度。對豬群進行定期的抗體監(jiān)測可以做到防患于未然，及早發(fā)現(xiàn)問題，及早采取措施。

1.1 血凝試驗

某些病毒具有凝集紅細胞的特性，比如，豬細小病毒可以凝集豚鼠紅細胞[2]?，F(xiàn)在常用的是豬瘟病毒的正向間接血凝試驗來監(jiān)測豬瘟病毒的抗體[3]，操作簡便，價格低廉，具有快速、敏感、特異性強等特點。

1.2 中和試驗

中和試驗的原理就是病毒與樣本中的抗體結合以后失去感染細胞的能力，試驗方法主要有簡單定性試驗、固定血清稀釋病毒法、固定病毒稀釋血清法、空斑減少法等。中和試驗檢測結果確實，但是中和試驗需要涉及細胞培養(yǎng)等，操作成本和技術水平要求都比較高，檢測周期也較長，故用之較少[4]。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA的基本方法就是將已知的抗原吸附在反應板上，加待測樣品、底物和酶標抗體（或酶標二抗），測定酶與底物反應產(chǎn)物顯色的深淺，可以對待測樣品的抗體水平進行定量[5]。ELISA方法除上述外還可用于豬抗體檢測的是斑點ELISA[6]。還可以用已知抗體包被反應板，檢測樣本中的病毒含量。ELISA方法的優(yōu)點是操作簡單、時間短、可同時檢測大量樣本，敏感性和特異性都比較強，目前已開發(fā)有多種商品化ELISA試劑盒。雖然該方法成本相對較高，但在臨床檢測中是抗體監(jiān)測最為常用、準確的方法。

1.4 膠體金技術

膠體金技術是在酶聯(lián)免疫吸附法的基礎上發(fā)展起來的一種固相標記免疫測定新技術。 其檢測原理是以硝酸纖維素膜為載體，標記已知抗原，待檢樣本血清經(jīng)膜的毛細管作用， 樣本中的抗體與膠體金上的抗原相結合，膜上標記物顯色而達到檢測目的[7]。此種技術快速，操作簡單，主要應用于豬病現(xiàn)場檢測?，F(xiàn)已有豬瘟、口蹄疫、藍耳等數(shù)種商品化膠體金試紙。

2 病原檢測

鑒于當前疫病流行的復雜性，單純通過臨床癥狀或解剖眼觀病理變化是很難做出準確的診斷的?？梢圆杉糠植∝i或死豬相關組織作為病料，送實驗室進行病原檢測，只有查明病原才能更好地、有針對性地采取相應的防治措施，減少臨床工作盲目性。

2.1 細菌性疾病

細菌性疾病在豬病臨床中占有重要地位，如，仔豬黃白痢、豬丹毒、支原體、副豬、胸膜肺炎、豬肺疫、梭菌性腸炎等，都在養(yǎng)豬生產(chǎn)中造成嚴重危害，帶來巨大經(jīng)濟損失。

2.1.1 分離細菌

無菌采集病死豬肝臟、肺臟或者其他病變嚴重的臟器（腹瀉性疾病可以采集腸道菌樣分離培養(yǎng)），以滅菌接種環(huán)接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，35～37℃培養(yǎng)24～48h。懷疑某些特定細菌病時可以用特殊的培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。如，麥康凱培養(yǎng)基可以鑒別大腸桿菌，副豬嗜血桿菌需要在培養(yǎng)基中添加輔酶等，產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離培養(yǎng)最好使用厭氧肉肝湯進行厭氧培養(yǎng)。取培養(yǎng)物染色鏡檢，根據(jù)細菌鏡下形態(tài)及染色特性，即可初步鑒別部分細菌。亦可直接由病料觸片染色鏡檢，但檢出率相對低一些。進一步鑒定可以通過生化試驗、血清學試驗、PCR等方法途徑。

2.1.2 藥敏試驗

分離細菌一個重要的目的就是進行抗菌藥物的敏感性試驗，在培養(yǎng)基上均勻涂布菌液，把帶有一定量藥物的藥敏紙片均勻貼附在平板上，恒溫培養(yǎng)?？梢酝ㄟ^測量紙片周圍抑菌圈的直徑來分析藥物對該細菌的敏感性（如圖1）。我們對一株分離自腹瀉哺乳仔豬的大腸桿菌做了藥敏試驗，做了兩個平行樣，結果顯示：該菌對阿米卡星、恩諾沙星、大觀霉素高敏，對頭孢噻呋、鏈霉素中敏，對阿莫西林、林可霉素、氟苯尼考耐藥。

藥敏試驗在于豬病治療臨床上具有重要意義，特別是如今細菌耐藥性日益嚴重，而新型抗菌藥物研發(fā)進展緩慢的形勢之下，我們獸醫(yī)臨床更應該拒絕盲目用藥和經(jīng)驗用藥，在抗菌藥物的使用上必須慎重，要根據(jù)藥敏試驗結果來指導臨床用藥選擇。

2.1.3 水源及環(huán)境監(jiān)測

定期監(jiān)測豬場周圍水源和環(huán)境中細菌分布情況，對于把握細菌病的流行情況具有積極意義。從源頭上切斷傳染病的傳播途徑。

圖1 藥敏試驗

2.2 病毒性疾病

2.2.1 聚合酶鏈式反應（PCR）

PCR技術是從基因水平上檢測病原，其原理就是大量擴增目的條帶，擴增到我們能夠看到它們。即，我們懷疑某種疾病，就可以根據(jù)該病原的DNA序列設計一條引物，假如我們的病料中含有該病原，那么就一定存在該病原的基因，也就可以與引物按照堿基互補的原則特異性結合，在經(jīng)過大量的擴增之后就可以通過凝膠電泳觀察到目的條帶，證明樣品陽性[8]。如無，則可說明該病料呈陰性。圖二是運用PCR技術檢測病料樣本中有無豬瘟病毒，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后成像，就可以直觀顯示結果。我們可以看到，這些樣本中豬瘟病毒的陽性率為6.7%（1/15），PCR技術應用于豬病診斷，具有敏感性高、特異性強、快速簡單等優(yōu)點，缺點是儀器成本投入較大、不能準確定量。

圖2

2.2.2 熒光定量PCR

實時熒光定量PCR即在PCR體系中加入熒光探針，通過熒光實時監(jiān)測PCR進程，與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR具有特異性更強，能夠有效解決PCR產(chǎn)物污染、自動化程度高，其最為突出的優(yōu)點是能夠對樣本進行快速、定量分析[9]。但該技術同樣也受設備成本限制，故不如PCR普遍。

2.2.3 動物回歸實驗

我們還可以將病料接種到易感實驗動物，輔助診斷，衡量毒力。如果成功在實驗動物中復制出相應病例，則可以確診。如偽狂犬病毒接種到實驗兔可出現(xiàn)特異性奇癢、抓撓癥狀[10]。但該方法所需周期較長，臨床診療中可能缺乏時效性。

此外，我們還可以將病料接種到細胞上，觀察細胞病變。

3 豬病綜合防治

在目前的豬病臨床診療過程中，由于技術水平、成本限制等因素，不可避免地存在一些病原診斷困難或者不精確的情況。同時，在養(yǎng)豬生產(chǎn)實踐中，濫用藥物、消毒意識差、疫苗管理應用不當、飼養(yǎng)管理不科學、缺乏有效的疫情監(jiān)測手段等情況也是時有發(fā)生。筆者拙見，認為豬病控制必須從養(yǎng)豬生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)出發(fā)，綜合控制，即提高飼養(yǎng)管理水平與實驗室檢測相結合。

首先，豬場應該堅持自繁自養(yǎng)，全進全出，這個概念已經(jīng)不是新詞了，遺憾的是，目前只有規(guī)?；筘i場有條件做到。如有引種需要，應當確認引種豬場是否存在本豬場沒有的疾病，引進豬只需隔離，采樣做實驗室檢測，防治疫病傳入。其次就是建立完善的消毒制度，批次間應當徹底清理、消毒，平時堅持使用兩種或兩種以上不同消毒機制的消毒藥物輪換使用，定期消毒，當發(fā)生傳染性疾病時，應該做到隔天消毒甚至每天消毒。

此外豬場另一個不可忽視的重要因素就是糞污處理問題，豬場每天產(chǎn)生大量糞污，糞污本身就是傳染病重要的傳播途徑。豬場應該建立有效的生物安全體系，采用蓄糞池對糞便進行集中堆積發(fā)酵處理，從而阻斷細菌、病毒的擴散。

豬病防治最為有效、不可缺少的環(huán)節(jié)，就是防疫。正確使用生物制品，加強疫苗管理，確保冷鏈安全運輸，杜絕使用假冒偽劣疫苗。為了達到科學、合理地免疫接種，預防接種應有周密的計劃，根據(jù)當?shù)馗鞣N傳染病的發(fā)生和流行情況，擬定每年的預防接種計劃。通過抗體監(jiān)測，確定合適的首免日齡，以降低母源抗體的干擾，定期檢測抗體水平，抗體不合格及時補免。有條件的豬場還應進行豬瘟、偽狂犬等抗原監(jiān)測，及時淘汰抗原陽性豬，以防止種豬帶毒，污染豬場。

針對藥物使用的混亂情況，應當使用細菌培養(yǎng)初步區(qū)分細菌性或病毒性疾病，并開展藥敏試驗。選用高效藥物，有效控制病情，提高治愈率。同時可以避免耐藥性的產(chǎn)生。如確診為病毒病，則應及時進行相應疫苗的緊急免疫，以避免更大的損失。

[1]倪嬌,隋軍鋒,焦連國,侯高偉,劉天倫,呂帥陽,趙亞榮.4種病毒性豬病流行病學調(diào)查與分析[J].中國獸藥雜志，2012,46(06):8-10.

[2]蔣玉雯,黃安國,馮軍,鄭儒標,關大沛,滕永毅.用微量血細胞凝集抑制試驗檢測豬細小病毒血凝抑制抗體[J].中國獸醫(yī)雜志，1986,(05):9-11.

[3]呂曉娟,郭偉,趙佳,畢敏.正向間接血凝試驗檢測豬瘟免疫抗體的應用[J].畜牧與獸醫(yī),2015,47(11):138.

[4]李嬌,王金良,沈志強. 豬瘟抗體的幾種常用檢測方法概述[J]. 養(yǎng)豬,2013,(06):126-128.

[5]羅毅.用酶聯(lián)免疫吸附試驗對豬瘟免疫及抗體效價監(jiān)測的效果分析[J].畜牧市場,2005,(08):139-141.

[6]洪云平,曹三杰,文心田. 斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測豬瘟血清抗體最佳條件的研究[J]. 畜禽業(yè),2006,(09):6-9.

[7]任娟.膠體金免疫層析技術研究現(xiàn)狀及進展[J]. 新疆畜牧業(yè),2011,(12):22-24.

[8]李玥瑩. DNA體外擴增技術——聚合酶鏈式反應(PCR)[J]. 沈陽師范學院學報(自然科學版),2000,(04):40-44.

[9]武昱孜,熊祺琰,劉蓓蓓,張珍珍,王佳,華利忠,韋艷娜,邵國青. 豬肺炎支原體和豬鼻支原體雙重熒光定量PCR檢測方法的建立[J]. 畜牧獸醫(yī)學報,2017,48(08):1491-1498.

[10]郝建偉. 規(guī)?；i場豬瘟、豬偽狂犬病綜合防控及凈化[D].中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院,2009.